Biosynthese von Ansamitocin P | Gansu-Lagertankgruppe

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 860 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mikrobielle bioaktive Naturstoffe vermitteln den produzierenden Stämmen ökologisch vorteilhafte Funktionen und werden in Klinik und Landwirtschaft häufig mit klar definierten Zielen und zugrunde liegenden Mechanismen eingesetzt. Die physiologischen Auswirkungen ihrer Biosynthese auf die produzierenden Stämme sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Es wurde festgestellt, dass das von Actinosynnema pretiosum ATCC 31280 produzierte Antitumormittel Ansamitocin P-3 (AP-3) das Wachstum des produzierenden Stamms in hoher Konzentration unterdrückt und auf das an der Zellteilung beteiligte FtsZ-Protein abzielt. Frühere Arbeiten deuteten auf das Vorhandensein zusätzlicher kryptischer Ziele von AP-3 in ATCC 31280 hin. Hier verwenden wir einen chemoproteomischen Ansatz mit einer von AP-3 abgeleiteten Photoaffinitätssonde, um die proteomweiten Wechselwirkungen von AP-3 zu profilieren. AP-3 weist spezifische Bindungen an die scheinbar nicht verwandte Desoxythymidindiphosphat-Glucose-4,6-Dehydratase, Aldehyddehydrogenase und Flavin-abhängige Thymidylatsynthase auf, die jeweils am Zellwandaufbau, dem zentralen Kohlenstoffstoffwechsel und der Nukleotidbiosynthese beteiligt sind. AP-3 fungiert als nicht-kompetitiver Inhibitor aller drei oben genannten Zielproteine und erzeugt physiologischen Stress auf den produzierenden Stamm, indem es verschiedene Stoffwechselwege stört. Die Überexpression dieser Zielproteine erhöht die Stammbiomasse und steigert die AP-3-Titer deutlich. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Identifizierung und Entwicklung kryptischer Ziele bioaktiver Naturstoffe zu einem tiefgreifenden Verständnis der mikrobiellen Physiologie und verbesserten Produkttitern führen kann.

Mikroben, zum Beispiel Aktinobakterien und Pilze, sind ein reiches Repertoire an Naturstoffen mit unterschiedlichen Strukturen und Bioaktivitäten, die als antibakterielle, antimykotische, antitumorale, immunsuppressive, cholesterinsenkende Mittel usw. eingesetzt werden1. Aufgrund der breiten Anwendung mikrobieller Naturstoffe in Klinik und Landwirtschaft wurden ihre Wirkungsweisen und gezielten zellulären Komponenten in verschiedenen Krankheitserregern und infizierten Geweben gut charakterisiert. Beispielsweise zielt das antibakterielle Penicillin auf Transpeptidasen ab, die zu den Penicillin-bindenden Proteinen (PBPs) gehören, und hemmt die Peptidoglycan-Biosynthese in Bakterien2; Das Immunsuppressivum Rapamycin bindet an das menschliche FK506-Bindungsprotein FKBP12, und anschließend hemmt der gebildete binäre Komplex das Zielprotein von Rapamycin (TOR), um die immunsuppressive Wirkung auszuüben3.

Interessanterweise wurden aufgrund der Entwicklung der chemoproteomischen Technologie unter Verwendung von aus Arzneimitteln gewonnenen chemischen Sonden mehr Arzneimittelbindungsproteine identifiziert, die an mehreren physiologischen Signalwegen beteiligt sind, was auf zusätzliche biologische Funktionen eines bestimmten Arzneimittels schließen lässt4. Mithilfe synthetischer β-Lactam-Derivate mit unterschiedlichen Seitenkettensubstitutionen als Sonden für die In-vivo-Markierung identifizierten Staub und Sieber nicht nur die bekannten PBPs, sondern auch nicht-PBP-bakterielle Ziele, darunter den Virulenzfaktor ClpP und eine mit Resistenzen verbundene β-Lactamase5. Kürzlich haben Sun et al. identifizierten STAT3 als neues Ziel von Rapamycin und dessen Unterdrückung des Tumorwachstums unter Verwendung eines photoaktiven Rapamycin-Analogons6.

Allerdings sind die Auswirkungen der Naturstoffproduktion auf ihre produzierenden Wirte noch nicht ausreichend erforscht. Die zellulären Ziele einiger Antiinfektiva wurden größtenteils aus den bekannten Zielproteinen in Krankheitserregern abgeleitet und entsprechende Resistenzmechanismen in den produzierenden Stämmen charakterisiert7. Als Ziel des Anti-Tuberkulose-Rifamycins dient die β-Untereinheit der bakteriellen RNA-Polymerase8, deren Gegenstück mit Mutationen von N447, D438 und Q432 im Rifamycin-produzierenden Stamm Amycolatopsis mediterranei S699 identifiziert wurde; und diese Mutanten verleihen dem Wirt Selbstschutz9. In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass ein bestimmtes 23S-rRNA-N-Methyltransferase-Gen lmrB im Lincomycin-Biosynthese-Gencluster von Streptomyces lincolnensis vorhanden ist, um eine Resistenz gegen ergänztes Lincomycin10 bereitzustellen.

Ansamitocine (Abb. 1a) sind von Actinobakterien produzierte Maytansinoide mit außergewöhnlicher Antitumorwirkung; Sie zielen speziell auf Mikrotubuli ab und dienten als „Gefechtsköpfe“ in Immunkonjugaten zur Behandlung verschiedener Arten von metastasiertem Brustkrebs. Ansamitocine werden von Actinosynnema, Amycolatopsis und Nocardiopsis produziert, wobei die Mitglieder der Gattung Actinosynnema hauptsächlich für die industrielle Fermentation von Ansamitocinen verwendet werden11,12,13. Kürzlich haben wir herausgefunden, dass Ansamitocin P-3 (AP-3) in hoher Konzentration das Wachstum des produzierenden Stammes Actinosynnema pretiosum ATCC 31280 (im Folgenden als ATCC 31280) (Ergänzungstabelle 1) unterdrückt, indem es auf das Zellteilungsprotein FtsZ abzielt. ein β-Tubulin-ähnliches Protein in Bakterien. Die Überexpression des FtsZ-kodierenden Gens verbesserte offensichtlich die Resistenz des rekombinanten Stamms gegenüber AP-3, was sich in einem besseren Wachstum als beim Ausgangsstamm in Gegenwart von 300 mg/L AP-3 zeigte. Allerdings litt das Wachstum des rekombinanten Stamms in Gegenwart von exogenem AP-3 immer noch unter einer geringeren Biomasse, was darauf hindeutet, dass FtsZ möglicherweise nicht das einzige Ziel von AP-314 ist. Daher schlugen wir vor, dass im produzierenden Stamm andere kryptische Ziele von AP-3 vorhanden sein könnten. Die Identifizierung dieser Ziele wäre entscheidend, um den durch die AP-3-Biosynthese verursachten Stress zu verstehen und den AP-3-Titer dann weiter zu verbessern .

a Chemische Struktur von AP-3. Die Schlüsselnummerierung ist in der Struktur gekennzeichnet. b Wachstumsprofile von Wildtyp ATCC 31280 und der AP-3-Nullmutante HQG-3 in YMS-Medium. Die Abweichung des Trockenzellgewichts zwischen ATCC 31280 und HQG-3 wird in Prozent angezeigt. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt. P-Werte wurden unter Verwendung eines zweiseitigen Student-t-Tests unter der Annahme ungleicher Varianz berechnet; *P < 0,1; **P < 0,05; ***P < 0,01. c Myzel des Stammes ATCC 31280 in der stationären Phase, das nach der Fragmentierung kurze Stäbchen zeigt. d Verzweigtes und teilweise gebrochenes Myzel von HQG-3 in der stationären Phase. Die Gesamtlänge des Maßstabsbalkens des REM-Bildes beträgt 5 μm.

Daher verwendeten wir eine von AP-3 abgeleitete spezifische Photoaffinitätssonde in Kombination mit einer auf Massenspektrometrie (MS) basierenden quantitativen Analyse, um die kryptischen Ziele von AP-3 im produzierenden Stamm ATCC 31280 zu untersuchen. Unsere Analysen ergaben, dass die Biosynthese von AP- 3 störte die Physiologie von ATCC 31280 auf Multi-Target-Weise mit Desoxythymidindiphosphat-Glucose-4,6-Dehydratase (dTGD), Aldehyddehydrogenase (ALDH) und Flavin-abhängiger Thymidylat-Synthase (FDTS) als AP-3-Targets. Die rekombinanten Stämme, die diese Proteine überexprimierten, zeigten unter AP-3-Exposition eine erhöhte Biomasse und auch deutlich höhere AP-3-Titer.

Um die potenzielle Fähigkeit von AP-3 (Abb. 1a) zu untersuchen, physiologische Störungen des produzierenden Stamms zu verursachen, haben wir den gesamten Ansamitocin-Biosynthese-Gencluster (Ansa-Cluster) durch doppelte Crossover-Rekombination im Stamm ATCC 31280 unter Verwendung des von pJTU1278 abgeleiteten Plasmids zerstört ( Ergänzungstabelle 2). Dies wurde erreicht, indem PCR-amplifizierte stromaufwärts und stromabwärts flankierende Sequenzen mit zwei Paaren bestimmter Primer (Ergänzungstabelle 3) kloniert wurden, wodurch der rekombinante Stamm HQG-3 als Referenzstamm erzeugt wurde (Ergänzungstabelle 1). Das Wachstum der beiden Stämme wurde in YMS-Medium verglichen (Ergänzungstabelle 4) und die Ergebnisse zeigten, dass die Biomasse von HQG-3 der des Stammes ATCC 31280 überlegen war. Die Unterschiede in der Biomasse nahmen während des exponentiellen Wachstums allmählich zu, so dass die Die Biomasse von HQG-3 war am vierten Tag der Fermentation um 22 % größer als die des Wildtyp-Stammes (Abb. 1b), was wahrscheinlich auf das Fehlen der AP-3-Produktion in HQG-3 zurückzuführen ist. Beobachtungen der Myzelmorphologie in der stationären Phase mittels Rasterelektronenmikroskopie ergaben, dass der Stamm ATCC 31280 nach der Fragmentierung eine Morphologie aus kurzen Stäbchen aufwies, während die Myzelien von HQG-3 verzweigt und teilweise gebrochen waren (Abb. 1c, d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Biosynthese von AP-3 in seiner geringen Konzentration auch zu physiologischem Stress führt, der zu einem schlechteren Wachstum des produzierenden Stamms führt.

Um potenzielle Bindungsziele von AP-3 innerhalb des Stammes ATCC 31280 zu identifizieren, haben wir eine spezifische chemoproteomische Sonde entwickelt und eine MS-basierte quantitative Analyse durchgeführt. Gemäß der Struktur-Aktivitäts-Beziehung von AP-3 hat die Methylierung an C20 einen vernachlässigbaren Beitrag zu seiner biologischen Aktivität13. Daher kamen wir zu dem Schluss, dass diese Methylgruppe durch eine Diazirin-Alkin-Einheit (YNE) ersetzt werden könnte, um eine Sonde zu erzeugen. Daher haben wir das Methyltransferase-kodierende Gen asm716 im Stamm ATCC 31280 zerstört, um mutiertes HQG-1 zu erzeugen (ergänzende Abbildung 2a, b), das 20-Demethyl-Ansamitocin P-3 (QG-1) anreicherte, wie durch Flüssigkeitschromatographie bestimmt (LC)-MS-Analyse (Ergänzende Abbildung 2c – f). Die YNE-Einheit wurde durch Anwendung von K2CO3 an der phenolischen Hydroxylgruppe an C20 von QG-1 installiert, um die Photoaffinitätssonde QG-YNE zu erzeugen (Abb. 2a). Die chemische Struktur der Verbindung QG-YNE wurde durch MS und Kernspinresonanzanalyse bestätigt (Ergänzende Abbildungen 3–5). Die Bioaktivitätsanalyse unter Verwendung der AP-3-empfindlichen Hefe Filobasidium uniguttulatum als Indikatorstamm17 zeigte, dass die Sonde QG-YNE das Hefewachstum in einem vergleichbaren Ausmaß wie AP-3 hemmte (Abb. 2b), was darauf hindeutet, dass die Anbindung der YNE-Einheit das Hefewachstum nicht beeinträchtigte biologische Wirksamkeit von QG-YNE.

a Chemische Strukturen von QG-1 und QG-YNE. b Vergleich der Bioaktivitäten von AP-3 und der Sonde QG-YNE mit einem Hefe-Indikatorstamm. c Venn-Diagramm, das eine Überlappung von 14 AP-3-bindenden Proteinen in den Fraktionen mit hoher Häufigkeit aus drei chemoproteomischen Tests mit unterschiedlichen UV-Belichtungszeiten zeigt. d Toleranz gegenüber rekombinanten Stämmen, die AP-3-bindende Proteine gegenüber exogenem AP-3 (200 mg/L) überexprimieren. Die Diskrepanz der Biomasse zwischen ATCC 31280 und rekombinanten Stämmen wird als Prozentzahl angezeigt. Orange Balken, Biomasse höher als die des Wildtyps; weiße Balken, Biomasse geringer als beim Wildtyp; grauer Balken, Wildtyp. *P < 0,1; **P < 0,05, ***P < 0,01. e Resistenz von HQG-7, HQG-13 und HGQ-17 gegenüber 400 mg/L exogenem AP-3.

Zur Identifizierung der AP-3-bindenden Proteine wurden Zelllysate des Stammes ATCC 31280 2 Stunden lang mit QG-YNE vorinkubiert und anschließend mit UV-Licht bestrahlt. Nach einer Klickreaktion mit Streptavidin-Magnetkügelchen führten wir Pulldown-Manipulationen durch, um an QG-YNE gebundene Proteine einzufangen und anzureichern. Die Perlen wurden durch tryptischen In-situ-Verdau von den Proteinen getrennt, und die Reaktionen wurden dann mit isobaren Massenmarkierungsreagenzien (TMT-126/127) markiert, die einzigartige Reporter enthielten (ergänzende Abbildung 6). Schließlich wurden die Peptidfragmente mittels MS analysiert und die erhaltenen funktionellen Proteominformationen wurden mit einem Faktor > 1 für das Verhältnis von TMT-127/126 gefiltert.

Die gewonnenen Proteine (Fragmente) wurden mit den annotierten Proteinen des Stammes ATCC 31280 verglichen und aus drei unabhängigen Untersuchungen von AP-3-bindenden Proteinen unter Verwendung schrittweise verkürzter UV-Bestrahlungszeiten erhielten wir eine Anreicherung von 708, 490 bzw. 83 Kandidaten. Die Auswirkungen verschiedener UV-Bestrahlungen auf die einzelnen Ergebnisse waren reproduzierbar, und die Venn-Diagramm-Analyse ergab 14 Bindungsproteine, die bei den drei UV-Bestrahlungszeiten gemeinsam waren (Abb. 2c). Zusätzlich zur Methyltransferase Asm7, die das biosynthetische Zwischenprodukt Ansamitocin methyliert16, waren die anderen 13 Kandidatenproteine mit verschiedenen Stoffwechselwegen verbunden, darunter Aldehydstoffwechsel, Zellwandsynthese, Nukleinsäurebiosynthese und Regulierungswege (Ergänzungstabelle 5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch die AP-3-Biosynthese verursachte Belastung des Wachstums und der morphologischen Veränderungen über verschiedene Stoffwechselwege entstehen könnte.

Da die meisten AP-3-bindenden Proteine an wesentlichen Stoffwechselprozessen wie Zellteilung, Zellwandaufbau, Nukleotidbiosynthese und zentralem Kohlenstoffstoffwechsel beteiligt sind, war es nicht möglich, mithilfe der Genstörung ihre möglichen Auswirkungen auf den produzierenden Stamm zu untersuchen. Aus diesem Grund haben wir einen Satz integrativer Überexpressionsplasmide entworfen, die jedes der Bindungsproteingene enthalten, die unter der Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors kasOp * 18 kloniert wurden (Ergänzende Abbildungen 7, 8). Asm7 wurde in diesem Fall ausgeschlossen, da es für die Methylierung an der C20-Position von AP-3 verantwortlich ist und APASM_6814 und APASM_6815 eine Genkassette für ihre Koexpression bilden. Daher wurden nur 12 Überexpressionsplasmide konstruiert und separat in den Stamm ATCC 31280 eingeführt (Ergänzungstabelle 2). Die resultierenden rekombinanten Stämme wurden auf ihre Toleranz gegenüber AP-3 untersucht, indem die Fermentationskulturen mit einer Endkonzentration von 200 mg/L AP-3 ergänzt wurden. Die Biomasse wurde dann am fünften Tag bewertet, als die Kulturen die stationäre Phase erreichten. Stämme HQG-7, HQG-13 und HQG-17, die Aldehyddehydrogenase (ALDH) (kodiert durch Gen APASM_1052), Flavin-abhängige Thymidylatsynthase (FDTS) (kodiert durch Gen APASM_5765) und Desoxythymidin-Diphosphat-Glucose-4,6-Dehydratase überexprimieren (dTGD) (kodiert durch das Gen APASM_6307) zeigte unter allen 12 Mutanten, die Überexpressionsplasmide trugen, eine bessere AP-3-Toleranz als der Wildtyp-Stamm (Abb. 2d). Die Stämme HQG-7, HQG-13 und HQG-17 wurden zusätzlich mit einer höheren Konzentration an AP-3 (400 mg/L) belastet, und die quantitative Analyse der Biomasse am fünften Tag der Fermentation ergab ein besseres Wachstum dieser Stämme deutlich verbesserte Toleranz von AP-3, bestimmt durch Steigerung der Biomasse um 45 %, 42 % bzw. 27 % im Vergleich zu ATCC 31280 (Abb. 2e). Wie aus den Annotationen und Funktionsstudien in anderen Bakterien zu diesen drei Proteinen hervorgeht, katalysiert APASM_1052-kodiertes ALDH die Oxidation von Aldehyden; APASM_5765-codiertes FDTS ist an der Synthese von dTMP aus dUMP beteiligt; und APASM_6307-kodiertes dTGD vermittelt die dTDP-L-Rhamnose-Bildung, die an der Synthese der Bakterienzellwand und -kapsel beteiligt ist (ergänzende Abbildung 9)19, was auf die verschiedenen Stoffwechselprozesse hinweist, die von AP-3 beeinflusst werden.

dTGD oxidiert die C4-Hydroxylgruppe von D-Glucose mit NAD(H) als Cofaktor, gefolgt von einer Dehydratisierung, die zur Bildung des dTDP-L-Rhamnose-Vorläufers dTDP-6-Desoxy-D-xylo-4-hexulose führt ( Ergänzende Abbildung 10). Verschiedene genetische Studien haben ergeben, dass die Aufhebung der dTDP-L-Rhamnose-Biosynthese die Virulenz einiger pathogener Bakterien stark abschwächt und sogar die Lebensfähigkeit beeinflussen kann20. Um die Wechselwirkung zwischen AP-3 und dTGD zu untersuchen, haben wir heterolog exprimiertes dTGD aus E. coli gereinigt (ergänzende Abbildung 11) und mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) die Wechselwirkung zwischen dTGD und AP-3 bei unterschiedlichen Konzentrationen analysiert. Es wurde festgestellt, dass AP-3 mit einer Affinitätskonstante KD von 3,60 × 10–4 M an dTGD bindet, was der KD für die Wechselwirkung zwischen Asm7 aus dem AP-3-Biosyntheseweg16 und AP-3 ähnelt (Abb. 3a, Ergänzung). Tabelle 6). Die MS-Analyse der an die Photoaffinitätssonde QG-YNE gebundenen dTGD-Peptidfragmente ergab, dass das Peptid 314-DNRDWWEPLKQR-325 das spezifisch einbauende Peptid war, das den erwarteten Anstieg von 712,31 Da (entspricht QG-YNE mit einem N2-Verlust) aufwies Molekulargewicht, relativ zum unmodifizierten Peptidfragment. Eine weitere Analyse des sekundären MS-Spektrums (MS2) ergab, dass sich die Markierung an den Seitenketten-Carboxylgruppen von Arg325 und Gln324 von dTGD befand (Abb. 3b, ergänzende Abb. 12).

a Die Wechselwirkung zwischen AP-3 und dTGD wurde durch SPR nachgewiesen, was einen KD-Wert von 3,60 × 10−4 M ergab. b MS2-Spektrum eines QG-YNE-modifizierten Peptids aus dTGD (314-DNRDWWEPLKQR-325 (Q324 + 712,31 Da). ) (R + 712,31 Da)). c Gesamtansicht des AP-3- und dTGD-Homomonomerkomplexes. Die Abstände (Å) zwischen den konservierten katalytischen Aminosäuren und AP-3 sind durch gestrichelte Linien angegeben. Hellgrau, dTGD-Homomonomer; himmelblau, AP-3; gelb, Peptid markiert mit QG-YNE; orange, durch QG-YNE modifizierte Aminosäure; violett, konservierte Aminosäure von dTGD. d Die Hemmkinetik von AP-3 mit dTGD wird durch doppelte reziproke Diagramme dargestellt, die unter Verwendung von 0,31 oder 0,63 mM AP-3 oder 1 % (v/v) DMSO (der Kontrolle) erstellt wurden. Die Daten werden als Mittelwerte dargestellt, wobei die Fehlerbalken die SD aus drei unabhängigen Experimenten darstellen. e Myzelmorphologie der Stämme ATCC 31280 (linkes Feld) und HQG-17 (mittleres Feld) am fünften Tag der Fermentation. Rechtes Bild, Vergleich der Myzelstablängen. Die Diskrepanz der Myzellänge zwischen ATCC 31280 und HQG-17 wird in Prozent angezeigt. Die Gesamtlänge des Maßstabsbalkens des REM-Bildes beträgt 5 μm. Die Daten werden als Mittelwerte mit Fehlerbalken dargestellt, die die SD aus fünf unabhängigen Experimenten darstellen; ***P < 0,01.

Um ein umfassendes Verständnis der AP-3-Interferenz mit der katalytischen Fähigkeit von dTGD zu erlangen, wurde die molekulare Architektur von dTGD mit dem AlphaFold2-Server etabliert. Die flexible Strukturausrichtung homologer Proteine und DesIV aus Streptomyces venezuelae (PDB-Eintrag 1r66) zeigte, dass ihre Architekturen mit einem RMSD von 0,41 und der konservierten katalytischen Diade von Asp128 und Glu129 sehr ähnlich waren (ergänzende Abbildung 13). Die molekulare Docking-Analyse für AP-3 und dTGD legte nahe, dass AP-3 mit einer Affinität von –5,96 kcal/mol an das Zielprotein band, und zwar über Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen mit benachbarten Aminosäureresten in der Bindungsregion. Der Bindungsbereich von AP-3 befand sich entfernt vom katalytisch aktiven Zentrum von dTGD und die Abstände zwischen der Hydroxylgruppe an C20 von AP-3 und Asp128 und Glu129 von dTGD betrugen 34,40 Å bzw. 30,50 Å (Abb. 3c). Die Hydroxylgruppe an C20, die zur Erzeugung der Photoaffinitätssonde QG-YNE modifiziert wurde, befand sich in der Nähe der Arg325- und Gln324-Reste von dTGD, in einem Abstand, der für die Vernetzung der Photoaffinitätsgruppe mit den Resten geeignet war, was mit der MS2-Analyse übereinstimmt (ergänzende Abb . 14).

Darüber hinaus führten wir eine quantitative Analyse der dTGD-Aktivität unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von dTDP-D-Glucose als Substrat und NAD+ als Cofaktor durch, überwacht mit einem Mikroplattenlesegerät bei 320 nm (A320) (ergänzende Abbildung 15). Unter optimierten Bedingungen wurden kcat und Km von dTGD mit 43,29 min−1 bzw. 0,15 mM gemessen. Die kcat- und Km-Werte wurden auch in Gegenwart von 0,31 mM AP-3 mit 34,46 min-1 bzw. 0,17 mM oder in Gegenwart von 0,63 mM AP-3 mit 29,38 min-1 bzw. 0,18 mM bestimmt (Abb . 3d). Die Hemmkonstante (KI) von AP-3 wurde basierend auf den Zusammenhängen zwischen Km-Werten und verschiedenen Konzentrationen von AP-3 mit 1,10 mM berechnet (Ergänzungstabelle 7). Diese Ergebnisse legen nahe, dass AP-3 als nicht-kompetitiver Inhibitor von dTGD fungiert.

Da die Störung des für dTDP-D-Glucose-4,6-Dehydratase kodierenden Gens bei Proteus mirabilis21 zu einer bis zu 40-fachen Zellverlängerung führte, verglichen wir die Myzelmorphologie der Stämme ATCC 31280 und HQG-17. Interessanterweise war die durchschnittliche Einzelzelllänge von HQG-17 statistisch etwa 1,65-mal länger als die von ATCC 31280, wie durch Rasterelektronenmikroskopie mit Kulturen in der stationären Phase beobachtet wurde (Abb. 3e), was darauf hindeutet, dass AP-3 dTDP-L- hemmen könnte. Rhamnose-Versorgung im produzierenden Stamm durch gezielte Bekämpfung von dTGD.

Die Flavin-abhängige Thymidylat-Synthase (FDTS) führt ein mehrstufiges Reaktionsmuster aus, das die reduktive Methylierung von 2′-Desoxyuridin-5′-monophosphat (dUMP) zu 2′-Desoxythymidin-5′-monophosphat (dTMP) katalysiert. Während des Methylierungsprozesses katalysiert FDTS zunächst die Umwandlung von FAD in FADH2 unter Verbrauch von zwei Äquivalenten NADPH und überträgt dann eine Methylengruppe von 5,10-Methylentetrahydrofolat (mTHF) auf dUMP, um dTMP und 7,8-Dihydrofolat zu erzeugen . Sobald das mTHF in den Reaktionen unter O2-Bedingungen fehlt, fungiert FDTS als NADPH-Oxidase und katalysiert FADH2 und zwei Äquivalente von NADP, um FAD und H2O2 zu erzeugen (ergänzende Abbildung 16)22.

Um die Wechselwirkung zwischen FDTS und AP-3 zu charakterisieren, wurde rekombinantes FDTS durch heterologe Expression in E. coli erhalten (ergänzende Abbildung 11). Basierend auf der SPR-Biosensoranalyse wurde die Dissoziationskonstante KD von AP-3 mit FDTS zu 6,65 × 10–5 M bestimmt, was auf eine hohe Affinität von AP-3 für FDTS hinweist (Abb. 4a, Ergänzungstabelle 6). Um die für die AP-3-Bindung entscheidenden Reste zu identifizieren, wurde QG-YNE-markiertes FDTS verdaut und mittels LC-MS/MS analysiert. Es wurde festgestellt, dass das Peptid 90-HFSYSQLSQR-99 kovalent modifiziert war und eine Massenzunahme von 712,31 (entspricht QG-YNE mit Verlust von N2) im Vergleich zum unmodifizierten Peptidfragment aufwies. Die Aminosäuresequenz wurde anhand der zahlreichen b-Typ-Ionen, die nach der Fragmentierung durch hochenergetische Kollisionsdissoziation (HCD) gebildet wurden, eindeutig bestätigt. Eine weitere Analyse des MS2-Spektrums lokalisierte die Markierung des Restes Leu96 (Abb. 4b, ergänzende Abb. 17).

a Die Wechselwirkung zwischen AP-3 und FDTS wurde durch SPR nachgewiesen und ergab einen KD-Wert von 6,65 × 10−5 M. b MS2-Spektrum eines QG-YNE-modifizierten Peptids aus FDTS (90-HFSYSQLSQR-99 (L96 + 712,31 Da)) ). c Gesamtansicht des AP-3- und FDTS-Homo-Tetramer-Komplexes. Die Abstände (Å) zwischen den konservierten Aminosäuren und AP-3 sind durch gestrichelte Linien angegeben. Hellgrau, FDTS-Homomonomer; himmelblau, AP-3; gelb, Peptid markiert mit QG-YNE; orange, durch QG-YNE modifizierte Aminosäure; violette, konservierte Aminosäuren von FDTS. d Die Hemmkinetik von AP-3 mit FDTS wird durch doppelte reziproke Diagramme dargestellt, die mit 0,02 oder 0,04 mM AP-3 oder 1 % (v/v) DMSO (der Kontrolle) erstellt wurden. Die Daten werden als Mittelwerte dargestellt, wobei die Fehlerbalken die SD aus drei unabhängigen Experimenten darstellen. e Intrazelluläre dTMP-Konzentrationen der Stämme ATCC 31280, HQG-3 oder HQG-13 durch quantitative Analyse. Die Abweichung wird in Prozent angezeigt. **P < 0,05.

Anschließend wurde eine Homo-Tetramer-Struktur des FDTS mit dem AlphaFold2-Server simuliert. Die homologen Proteine und ThyX aus Thermotoga maritima (PDB-Eintrag 7ndz) zeigten eine hohe Ähnlichkeit mit einem RMSD von 1,67 und den hochkonservierten Ser97 und Tyr99 in aktiven Stellen (ergänzende Abbildung 18). Die molekulare Docking-Analyse zeigte, dass AP-3 mit einer Affinität von –6,76 kcal/mol an eine Region neben der katalytisch aktiven Tasche von FDTS band. AP-3 wurde im Komplex durch Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen mit wichtigen Aminoresten verankert. Die Abstände zwischen der Hydroxylgruppe an C20 von AP-3 und Ser97 und Tyr99 von FDTS betrugen 11,70 Å bzw. 12,40 Å (Abb. 4c). Die Hydroxylgruppe an C20 war mit einem Abstand von 3,80 Å zu Leu96 geschlossen, wodurch die Photoaffinitätsgruppe während der UV-Bestrahlung mit Leu96 verbunden wurde (ergänzende Abbildung 19).

Die NADPH-Oxidaseaktivität von FDTS wurde mit FAD als H+-Akzeptor und in Gegenwart von dUMP analysiert. Praktischerweise war NADPH durch lineare Absorption bei 340 nm in einem Bereich von 0,015 bis 1 mM nachweisbar (ergänzende Abbildung 20). Die kcat- und Km-Werte von FDTS für die Reduktion von NADPH wurden durch Überwachung der Reaktionen mit unterschiedlichen dUMP-Konzentrationen auf 57,63 min−1 bzw. 0,66 mM bestimmt. Da die katalytische Fähigkeit von FDTS durch AP-3-Konzentrationen über 0,08 mM gehemmt wurde, wurden die Reaktionen mit AP-3 in Endkonzentrationen von 0,02 oder 0,04 mM ergänzt. Die kcat- und Km-Werte wurden weiter zu 42,88 min-1 und 0,65 mM in Gegenwart von 0,02 mM AP-3 bzw. 33,03 min-1 und 0,69 mM mit 0,04 mM AP-3 berechnet (Abb. 4d). Diese Ergebnisse zeigten, dass AP-3 ein nicht-kompetitiver Repressor von FDTS mit einem KI-Wert von 0,05 mM war (Ergänzungstabelle 8).

Um den physiologischen Beitrag von FDTS weiter zu untersuchen, haben wir die intrazellulären dTMP-Konzentrationen der Stämme ATCC 31280, HQG-3 und HQG-13 gemessen. Die dTMP-Konzentration im Stamm HQG-13 war gegenüber den Werten in den Stämmen ATCC 31280 und HQG-3 um 14,3 % bzw. 8,3 % erhöht (Abb. 4e, ergänzende Abb. 21). Daher behindert die AP-3-Produktion die katalytische Aktivität von FDTS und führt zu einer verringerten dTMP-Versorgung für die DNA-Synthese im produzierenden Stamm.

ALDHs sind häufig an der Umwandlung von Aldehyden, die bei zellulären Stoffwechselprozessen entstehen, mit Hilfe des Cofaktors NAD(P)+ in Säuren beteiligt. Die meisten Aldehyde sind chemisch aktiv und physiologisch toxisch für die erzeugenden Organismen, und ALDHs sind an der Aldehyd-Entgiftung beteiligt und tragen zur Aufrechterhaltung des Reservoirs an Reduktionsäquivalenten bei23,24. Um die Wechselwirkungen zwischen ALDH und AP-3 zu charakterisieren, haben wir lösliches ALDH aus den Zelllysaten von Escherichia coli BL21 (DE3)-Rekombinanten gereinigt (ergänzende Abbildung 11) und die Affinität von AP-3 für ALDH durch SPR-Biosensoranalyse bestimmt. Der KD-Wert wurde für die Wechselwirkung von AP-3 mit ALDH mit 1,97 × 10–5 M bestimmt (Abb. 5a, Ergänzungstabelle 6). Um die von AP-3 gebundenen ALDH-Reste zu identifizieren, wurde rekombinantes ALDH mit QG-YNE fotomarkiert, mit Trypsin verdaut und mittels LC-MS/MS analysiert. Das Peptid 18-SRYDHFIGGEFTAPAK-33 zeigte eine Massenzunahme von 712,31 (entspricht QG-YNE mit Verlust von N2), und die MS2-Spektrumanalyse dieses Peptids lokalisierte die Markierung auf Arg19 (Abb. 5b, ergänzende Abb. 22).

a Die Wechselwirkung zwischen AP-3 und ALDH wurde durch SPR mit einem KD-Wert von 1,97 × 10–5 M nachgewiesen. b MS2-Spektrum eines QG-YNE-modifizierten Peptids aus ALDH (18-SRYDHFIGGEFTAPAK-33 (Arg19 + 712,31 Da) ). c Gesamtansicht des AP-3- und ALDH-Homomonomerkomplexes. Die Abstände (Å) zwischen den konservierten Aminosäuren und AP-3 sind durch gestrichelte Linien angegeben. Hellgrau, dTGD-Homomonomer interagiert mit AP-3; himmelblau, AP-3; gelb, Peptid markiert mit QG-YNE; orange, durch QG-YNE modifizierte Aminosäure; violette, konservierte Aminosäuren von ALDH. d Die Hemmkinetik von AP-3 mit ALDH wird durch doppelte reziproke Diagramme dargestellt, die unter Verwendung von 0,31 oder 0,63 mM AP-3 oder 1 % (v/v) DMSO (der Kontrolle) erstellt wurden. Die Daten werden als Mittelwerte dargestellt, wobei die Fehlerbalken die SD aus drei unabhängigen Experimenten darstellen. e Intrazelluläre Acetyl-CoA-, Zitronensäure- und Isozitronensäurekonzentrationen der Stämme ATCC 31280, HQG-3 oder HQG-7 durch quantitative Analyse. Die Abweichung wird in Prozent angezeigt. *P < 0,1; **P < 0,05; ***P < 0,01.

Anschließend wurde über den AlphaFold2-Server eine Homo-Tetramer-Architektur des ALDH erstellt. Der Vergleich homologer Proteine und ALDH aus Rindermitochondrien (PDB-Eintrag 1a4z) zeigte eine hohe Ähnlichkeit mit einem RMSD von 0,82 und konservierten Cys302- und Glu263-Schlüsselresten in den katalytisch aktiven Zentren (ergänzende Abbildung 23). Die Analyse des molekularen Docking-Komplexes ergab, dass AP-3 mit einer Affinität von −7,40 kcal/mol von der katalytisch aktiven Tasche von ALDH abwich. Die Abstände zwischen der Hydroxylgruppe an C20 von AP-3 und Cys302 und Glu263 von ALDH betrugen 38,40 Å bzw. 40,50 Å (Abb. 5c). Wasserstoffbrückenwechselwirkungen wurden zwischen der Carbonylgruppe der Acetyleinheit an C3 und Arg17 und zwischen der Hydroxygruppe an C9 und Arg17 mit Abständen von 3,30 Å bzw. 2,80 Å gebildet. Der Makrolactamring von AP-3 ist durch hydrophobe Wechselwirkungen an die Tasche von ALDH gebunden. Die Hydroxylgruppe an C20 näherte sich Arg19 mit einem Abstand von 4,20 Å, und dieser Abstand ermöglichte eine Verbindung zwischen der Photoaffinitätsgruppe der QG-YNE-Sonde und Arg19 von ALDH während der UV-Bestrahlung (ergänzende Abbildung 24).

Anschließend wurden die enzymatischen Reaktionen von ALDH mit Aldehyd als Substrat und NAD+ als Cofaktor etabliert. Bei der Umwandlung von Aldehyden in Säuren durch ALDH wurde das äquivalente NADH erzeugt, das bequem mit einem chromogenen Assay nachgewiesen werden konnte (ergänzende Abbildung 25). Die kcat- (8,40 min−1) und Km-Werte (0,10 mM) für die katalytische Aktivität von ALDH auf Aldehyde wurden bestimmt und anschließend wurden AP-3-Interferenzversuche mit ALDH durchgeführt. Die kcat- und Km-Werte wurden mit 5,48 min−1 bzw. 0,07 mM berechnet, wobei 0,31 mM AP-3 in den Reaktionen enthalten waren. kcat- und Km-Werte von 3,99 min−1 und 0,05 mM wurden außerdem in Gegenwart von 0,63 mM AP-3 nachgewiesen (Abb. 5d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass AP-3 als Inhibitor für ALDH diente, mit einem Inhibitionswert von KI = 0,82 mM (Ergänzungstabelle 9).

Darüber hinaus steigerte die Überexpression des ALDH-kodierenden Gens im Stamm HQG-7 die Akkumulation von intrazellulärem Acetyl-CoA um 90 % gegenüber den Werten im Stamm ATCC 31280, und dieser erhöhte Acetyl-CoA erhöhte folglich die Akkumulation von Isocitronensäure und Zitronensäure um 118 % 80 % bei HQG-7 im Vergleich zu Stamm ATCC 31280, was das Wachstum von HQG-7 mit ALDH-Überexpression steigert. Darüber hinaus wurden auch die intrazellulären Acetyl-CoA-, Zitronensäure- und Isozitronensäurespiegel im Ansa-Cluster-gestörten Stamm HQG-3 gemessen und es wurde festgestellt, dass sie im Vergleich dazu um 34 %, 8 % bzw. 21 % erhöht waren des Stammes ATCC 31280 (Abb. 5e, ergänzende Abb. 26, 27).

Da die Stämme, die die Gene ALDH, FTDS oder dTGD überexprimierten, im Vergleich zum Kontrollstamm während der Belastung mit hohen AP-3-Konzentrationen eine deutlich erhöhte Biomasse aufwiesen, untersuchten wir die AP-3-Produktion in diesen Rekombinanten weiter. Die Stämme ATCC 31280, HQG-7, HQG-13 und HQG-17 wurden in YMS-Medium kultiviert und anschließend wurde AP-3 aus den Kulturbrühen extrahiert. Die AP-3-Titer wurden zu 45,03 ± 0,95, 50,33 ± 5,46, 71,95 ± 6,95 mg/L und 83,47 ± 4,83 mg/L für die Stämme ATCC 31280, HQG-7, HQG-13 und HQG-17 bestimmt, d. h. Der AP-3-Titer steigt um 11,77 %, 59,78 % und 85,37 % durch die jeweilige Überexpression von ALDH, FDTS und dTGD (Abb. 6a, ergänzende Abb. 28).

Auswirkung einer verstärkten Expression von Zielproteinen auf AP-3-Titer in (a) Wildtyp-Stamm ATCC 31280 und (b) Hochertragsstamm WXR-24. Die Abweichung wird in Prozent angezeigt. ***P < 0,01.

Angesichts der erhöhten AP-3-Titer durch Überexpression von Zielen wurden die Überexpressionskonstrukte APASM_5765 (FDTS), APASM_6307 (dTGD) und APASM_1052 (ALDH) in einen AP-3-Hochertragsstamm WXR-24 eingeführt und erzeugten die Mutanten HQG-23. HQG-24 bzw. HQG-25. Nach der Fermentation in YMV-Medium wurden die AP-3-Titer gemessen und betrugen 225 ± 33,25, 395,5 ± 31,02, 348,33 ± 22,49 und 254 ± 22,1 mg/L für WXR-24, HQG-23, HQG-24 und HQG-25 bzw. (Abb. 6b).

Mikrobielle bioaktive Naturstoffe vermitteln ökologisch vorteilhafte Funktionen und können evolutionäre Vorteile gegenüber konkurrierenden Arten verschaffen25. Beispielsweise wirken Thiopeptide als spezifische Modulatoren mikrobieller Phänotypen, um die Bildung von Biofilmen auszulösen26; Bei unterhemmenden Konzentrationen fungieren Tobramycin, Tetracyclin und Norfloxacin als Signalmoleküle zur Überwachung der Homöostase mikrobieller Gemeinschaften und können die Produktion bioaktiver Verbindungen anregen, um die Beweidung durch Protozoen zu hemmen27. Allerdings scheinen die Auswirkungen der Naturstoffbiosynthese auf ihre produzierenden Stämme – seien sie nun vorteilhaft oder schädlich – weitgehend unbekannt zu sein. In unserer Arbeit haben wir bestätigt, dass die Biosynthese von Ansamitocinen durch Stress verursacht wurde und die Biomasse des produzierenden Stamms reduziert wurde, was entweder durch die Ergänzung der Kulturen mit exogenem AP-3 in hohen Konzentrationen14 oder durch die Löschung des Ansamitocin-Genclusters im Wildtyp gezeigt wurde (Abb . 2b). Darüber hinaus führten wir systematische Untersuchungen durch Struktursimulation und Bindungsproteinerfassung mit einer von AP-3 abgeleiteten Photoaffinitätssonde durch und identifizierten FtsZ, das für die Zellteilung essentielle zytokinetische Z-Ring-Protein14, und Desoxythymidindiphosphat-Glucose-4,6-Dehydratase (dTGD), Flavin -abhängige Thymidylatsynthase (FTDS) und Aldehyddehydrogenase (ALDH) als einheimische Ziele von AP-3, die maßgeblich für den durch die AP-3-Biosynthese verursachten Stress verantwortlich sind. Ähnliche Stresseffekte wurden beim opportunistischen Erreger Pseudomonas aeruginosa28 und beim Meeresbakterium Phaeobacter inhibens29 beobachtet. Der Pyocyanin-produzierende Wildtyp P. aeruginosa PA14 wies im Vergleich zur Δphz-Mutante mit gelöschtem Pyocyanin-Biosynthese-Gencluster eine höhere Zelltodrate auf, und eine exogene Ergänzung von Pyocyanin erhöhte die Zelltodrate der Δphz-Mutante28. Bei Phaeobacter inhibens führte die Inaktivierung der Tropodithietinsäure-Biosynthesegene zu einer höheren Biomasse und einer höheren Kohlenstoffnutzungseffizienz des Mutanten als beim Wildtyp29. Nachfolgende transkriptomische und proteomische Vergleiche ergaben eine hochregulierte Expression der verzweigtkettigen Aminotransferase IlvE, mehrerer Aufnahmesysteme für Aminosäuren und anorganische Nährstoffe sowie einiger Komponenten der Atmungskette30.

Chemoproteomische Ansätze wurden erfolgreich eingesetzt, um die Bindungsproteine von Mikrobiota-Primärmetaboliten (Fettsäuren, von aromatischen Aminosäuren abgeleitete Metaboliten, Vitamine, Gallensäuren usw.)31, Mykolsäuren in Mykobakterien32, Gallensäure in Clostridiodes difficile33 und Häm in Gram zu identifizieren -positive und gramnegative Bakterien34. Unseres Wissens nach wurde die Chemoproteomik jedoch bisher nicht eingesetzt, um das Bindungsspektrum bioaktiver Verbindungen in den Produzenten zu untersuchen. Während die aktivitätsbasierte Proteinprofilierungsmethode (ABPP) chemische Sonden verwendet, um katalytisch aktive Proteine spezifisch zu markieren35, untersucht der Photoaffinitätsansatz Sonden mit photoreaktiven Einheiten, wie der Diazringruppe, um mit allen spezifischen Bindungsproteinen zu interagieren und Vernetzungen zu bilden36. Wie in unseren Experimenten gezeigt, führten drei Vernetzungsreaktionen für die QG-YNE-Sonde und zelluläre Proteine zu einer effizienten und spezifischen Markierung mit 14 gemeinsam eingefangenen Proteinen (Abb. 2c), darunter Asm7 mit katalytischer Aktivität gegenüber Chloro-Proansamitocin16 und AP- 3 übt wahrscheinlich allosterische Wirkungen auf dTGD, FTDS und ALDH aus (Abb. 3d, 4d, 5d). Daher ist die Chemoproteomik in der Tat eine leistungsstarke Strategie zur Charakterisierung der proteomweiten Wechselwirkungen bioaktiver Verbindungen bei ihren Produzenten.

Wir haben viele genetische Strategien zur Erhöhung des AP-3-Titers entwickelt, darunter die Linderung geschwindigkeitsbegrenzender Biosyntheseschritte nach PKS37, die Abschwächung der Myzelfragmentierung15, eine verbesserte AP-3-Exportierung durch Überexpression von Exportgenen38 und eine verstärkte Resistenz durch Überexpression des Ziels Protein FtsZ14 mit einem Titeranstieg zwischen 24,94 % und 93 % und bis zu 330,6 mg/L. In Stämmen, die die AP-3-Zielproteine überexprimierten, stellten wir fest, dass die AP-3-Titer um bis zu 85 % bzw. 76 % gegenüber den Werten im Wildtyp-Stamm ATCC 31280 und im Hochertragsstamm WXR-24 anstiegen (Abb. 6). Dieses Ergebnis zeigte, dass die Expression von Zielproteinen in antibiotikaproduzierenden Stämmen für ein bestimmtes Antibiotikum notwendig ist und zur Titerverbesserung in Betracht gezogen werden sollte.

Während die Überexpression von dTGD und FTDS die Produktion von AP-3 erheblich steigerte, führte die Überexpression von ALDH interessanterweise nur zu einem beschleunigten Wachstum des produzierenden Stamms und hatte keinen Einfluss auf die AP-3-Produktion. ALDH oxidiert Acetaldehyd zu Essigsäure, die weiter in Acetyl-CoA umgewandelt werden kann. Acetyl-CoA ist nicht nur ein Schlüsselmolekül im zentralen Kohlenstoffstoffwechsel von Mikroben39, sondern wird auch enzymatisch in die Malonyl-CoA-Extender-Einheiten für die AP-3-Biosynthese umgewandelt40. Bemerkenswerterweise war die intrazelluläre Konzentration von Acetyl-CoA bei HQG-7, das ALDH überexprimierte, um 90 % höher als im Stamm ATCC 31280 (Abb. 5e). Um die Nutzung von Acetyl-CoA zu untersuchen, untersuchten wir weiter wichtige Zwischenprodukte im TCA-Zyklus und stellten fest, dass die intrazellulären Konzentrationen von Isozitronensäure und Zitronensäure in HQG-7 im Vergleich zum Stamm ATCC dramatisch um 118 % bzw. 80 % erhöht waren 31280. Daher wird der erhöhte Acetyl-CoA-Fluss in der ALDH-Überexpressionsmutante höchstwahrscheinlich eher auf den TCA-Zyklus und die Biomasseakkumulation als auf die Biosynthese von AP-3 umgeleitet.

Zusammenfassend konzentrierte sich unsere aktuelle Forschung auf die Gewinnung kryptischer Ziele des bioaktiven Sekundärmetaboliten AP-3 in seinem natürlich produzierenden Stamm mithilfe der Chemoproteomik und eines MS-basierten quantitativen Ansatzes. Es wurde festgestellt, dass AP-3 spezifisch an drei Proteinziele bindet und als deren nicht-kompetitiver Inhibitor fungiert. Unsere Ergebnisse deuten darüber hinaus darauf hin, dass die AP-3-Produktion einen physiologischen Stress für den Produzenten verursacht, der teilweise durch eine Überexpression der Zielproteine gemildert werden könnte. Darüber hinaus wurde durch die Verbesserung der Expression dieser Ziele auch eine Titerverbesserung von AP-3 erreicht. Diese Integration von Target-Screening und Engineering bietet ein großes Potenzial für die Aufklärung der biologischen Wirkungen bioaktiver Sekundärmetaboliten und ihrer kryptischen Ziele sowie für die Verbesserung von Stämmen für industrielle Anwendungen, einschließlich der Produktion von Antibiotika.

Detaillierte Informationen zu Kulturmedien, Stämmen, Plasmiden und Primern finden Sie in den Ergänzungstabellen 1–4. Die Escherichia coli-Stämme DH10B, ET12567 (pUZ8002) und BL21 (DE3) wurden als Wirte für die Klonierung, die bi-parentale Konjugation von E. coli und Actinosynnema bzw. die Proteinexpression verwendet. Das Plasmid pJTU1278 wurde zur Konstruktion der Gen-Disruptionsmutante verwendet. Der integrative Vektor pLQ648, der den konstitutiven starken Promotor kasOp* enthält, wurde angepasst, um Zielprotein-kodierende Gene zu überexprimieren, und pET30a wurde für die Proteinexpression verwendet.

Während der Fermentation wurden der Stamm ATCC 31280 und die Rekombinanten zunächst 48 Stunden lang bei 30 °C auf YMG-Platten kultiviert, dann wurden die Myzelien unter Schütteln bei 220 U/min in S1-Medium bei 30 °C überführt und 24 Stunden lang kultiviert. Anschließend wurde S1-Kultur in einer Endkonzentration von 3,3 % (v/v) in S2-Medium geimpft und weitere 24 Stunden bei 30 °C und 220 U/min kultiviert. Schließlich wurde die S2-Samenbrühe in einer Endkonzentration von 10 % (v/v) in YMS-Medium überführt und 7 Tage lang bei 25 °C und 220 U/min kultiviert, um die Biomasse und die AP-3-Titerschätzung in YMS/YMV-Medien zu ermitteln.

Zur quantitativen Analyse der AP-3-Titer (ergänzende Abbildung 28) wurde den endgültigen Fermentationskulturen ein gleiches Volumen Methanol zugesetzt und gerührt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang mit Ultraschall behandelt. Dann wurde 1 ml der Mischung gesammelt und zentrifugiert, und der Überstand wurde durch einen 0,22-µm-Filter filtriert und einer LC-MS-Analyse unterzogen. Für die LC-MS-Bestimmung wurden die Proben auf einem Agilent-System der Serie 1290-MS 6230 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) analysiert, das mit einer Agilent Eclipse Plus C18-Säule (4,6 × 250 mm, 5 µm) ausgestattet war, wobei die Elution mit erfolgte 45 % A (H2O mit 0,5 % Ameisensäure): 55 % B (Acetonitril) für 35 Minuten und Detektion bei 254 nm. Die Ionenquelle war ein AJS-ESI-Modell mit positiver Polarität. Die Gastemperatur, der Durchfluss und der Zerstäuberdruck betrugen 325 °C, 8 l/min bzw. 35 psi. Der Fragmentor, der Skimmer und OCT 1 RF Vpp wurden auf 175, 65 bzw. 750 V eingestellt. Alle Derivate von AP-3 wurden mit dieser Methode nachgewiesen oder isoliert. Die m/z verwandter Verbindungen wurden anhand hochauflösender Massenspektren berechnet und in den entsprechenden Legenden der ergänzenden Abbildung aufgeführt.

20-Demethyl-Ansamitocin P-3 (QG-1) (46,5 mg, 0,075 mmol) wurde in wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) (1,0 ml) gelöst und dann K2CO3 (20 mg, 0,15 mmol) und die Diazirin-Alkin-Einheit ( YNE41) (synthetisiert von Bioduro-Sundia, Shanghai, China, 3,1 mg, 0,0125 mmol) wurden nacheinander in die Lösung gegeben. Nach einstündigem Rühren bei 50 °C wurde die Reaktion durch Dünnschichtchromatographie mit mobiler Phase unter Verwendung von 95 % Dichlormethan und 5 % Methanol nachgewiesen, und dem Reaktionsgemisch wurde zusätzliches YNE (4,4 mg, 0,0178 mmol) zugesetzt, gefolgt von einer Inkubation bei 50 °C weitere 3 h im Dunkeln. Die Mischung wurde mit gesättigter Na2CO3 gewaschen und weiter mit 1 mol HCl und Salzlösung behandelt. Die organische Schicht wurde mit wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und dann filtriert und konzentriert. Der Rohextrakt wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gereinigt, um das gewünschte Produkt, QG-YNE (18 mg, 80,6 % Ausbeute), zu erhalten. 1H- und 13C-Kernresonanzspektren (NMR) wurden mit einem Bruker Advance 400 MHz in CDCl3-Spektrometer (1H-NMR, 400 MHz; 13C-NMR, 100 MHz) unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard aufgezeichnet.

Das Verfahren zum Einfangen des Zielproteins bestand aus der Ernte der Myzelien des Stammes ATCC 31280 am dritten Tag durch Zentrifugation bei 3488 × g (Thermo, TX-750), gefolgt von Waschen mit 7 % NaCl und Suspendieren in PBS-Puffer (150 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,2–7,4) und Zerkleinern mit einem Ultraschallprozessor. Die 10 mM chemische Sonde (QG-YNE) wurde mit 50 µL 30 mg/ml Zelllysat 2 Stunden lang vorinkubiert und dann weitere 20/10/5 Minuten mit UV-Licht bei 365 nm auf Eis bestrahlt, um zu erzeugen die kovalente Bindung zwischen der Diaziringruppe auf der Sonde und den Aminosäureresten der Zielproteine. Die Sondenbindungsproteine durchliefen eine weitere Klickreaktion mit 0,5 mM Biotin-N3, unterstützt durch 0,1 mM Tris-hydroxypropyltriazolylmethylamin (THTPA), 1 mM CuSO4 und 1 mM Vitamin C-Natrium (NaVc). Dann wurden 50 µl Streptavidin-Sepharose-Kügelchen (GE Healthcare) in jede Reaktionsprobe gegossen und 16 Stunden lang unter kontinuierlicher Rotation bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden nacheinander mit 600 µL 0,1 M PBS, 0,5 M NaCl, 4,0 M Harnstoff und 100 mM Triethylamoniumbicarbonat (TEAB) gewaschen. Die angereicherten Proteine wurden einer reduktiven Alkylierung mit 200 µL 10 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) und 200 µL 55 mM Iodacetamid unterzogen. Angereicherte Proteine wurden mit 0,25 µg Trypsin (Promega) über Nacht bei 37 °C verdaut. Die Verdaus sowohl der mit totem YNE (Diazirin-Alkin-Anteil, ergänzende Abbildung 6) als auch der mit QG-YNE behandelten Proben wurden mit TMT2−126 bzw. TMT2−127 Isobaric Label Reagent (Thermo Scientific) markiert. Die markierte Probe wurde auf eine Thermo Acclaim PepMap RSLC-Analysesäule (75 µM × 15 cm) gegeben und mit 0,1 % Ameisensäure in H2O und Acetonitril mit 0,3 µL/min gewaschen. Anschließend wurden die Peptidfragmente auf einem proteomischen Massenspektrometer Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific)42 analysiert.

Die asm7-Knockout-Mutante HQG-1 wurde aus dem Stamm ATCC 31280 mithilfe eines homologen Rekombinationsansatzes erhalten43. Der linke und rechte homologe Arm wurden durch PCR unter Verwendung der Primerpaare deasm7-LF/R bzw. deasm7-RF/R amplifiziert. Nach der Sequenzvalidierung wurden die DNA-Fragmente mithilfe eines DNA-Ligationskits (TaKaRa) an den Stellen BamHI/EcoRI und EcoRI/HindIII in einen von pJTU1278 abgeleiteten Shuttle-Vektor kloniert. Die konstruierten Plasmide wurden sequenziert, zunächst durch Transformation in E. coli ET12567 (pUZ8002) und dann durch Konjugation in den Stamm ATCC 31280 eingeführt. Nach der Kultivierung als YMG-Rasen mit 0,2 mg/ml Nalidixinsäure und Thiostrepton für 7 Tage bei 30 °C wurden die Exkonjuganten zwei Runden lang ohne Thiostrepton auf festem YMG-Medium weiter kultiviert. Anschließend wurden die Doppel-Crossover-Mutanten mittels PCR gescreent, um die Zielrekombinanten zu identifizieren. Der asm7-Deletionsmutant wurde HQG-1 genannt, und der rekombinante asmA-Störungsmutant HQG-3 wurde auf die gleiche Weise wie HQG-1 erhalten.

Gene, die für die Zielproteine kodieren, wurden unter Verwendung eines von pSET152 abgeleiteten integrativen Vektors überexprimiert, der den starken konstitutiven Promotor kasOp* enthielt. Diese Gene wurden durch PCR unter Verwendung entsprechender Primerpaare amplifiziert (Ergänzungstabelle 3), und nach der Sequenzierungsvalidierung wurden die Zielgene mithilfe des DNA-Ligationskits einzeln an den NdeI/EcoRI-Stellen in den von pSET152 abgeleiteten Shuttle-Vektor eingefügt. Die konstruierten Plasmide wurden zunächst durch Transformation in E. coli ET12567 (pUZ8002) und dann durch Konjugation in die produzierenden Stämme ATCC 31280 oder WXR-24 eingeführt. Nach der Kultivierung auf dem Rasen von YMG mit 0,2 mg/ml Nalidixinsäure und Apramycin für 4 Tage bei 30 °C wurden die Exkonjuganten auf YMG-Platten mit Apramycin und Nalidixinsäure übertragen, 2 Tage lang kultiviert und dann durch PCR validiert.

Um die AP-3-Toleranz zu testen, wurden die Stämme, die die Zielgene überexprimierten (Ergänzungstabelle 1), und der Kontrollstamm ATCC 31280 2 Tage lang auf festen YMG-Medien kultiviert. Nach der sukzessiven Kultivierung der Samenbrühe in S1- und S2-Medien wurden 0,15 ml S2-Myzelkulturen (durch OD600-Detektion auf eine ähnliche Anzahl koloniebildender Einheiten verdünnt) in Platten mit 24 tiefen Vertiefungen mit einem Gesamtvolumen von 1,5 ml überführt YMS-Medium mit einer Endkonzentration von 200 mg/L AP-3. Der Vergleich der Biomasse der Rekombinanten und des Stammes ATCC 31280 wurde nach 5 Tagen Fermentation durchgeführt. Die Bewertung der Toleranz der verwandten Stämme gegenüber AP-3 wurde anhand des Trockenzellgewichts am 5. Tag bestimmt. Zusätzlich wurden HQG-7, HQG-13, HQG-17 und der Stamm ATCC 31280 mit einer Endkonzentration von 400 mg/L fermentiert AP-3 in den Fermentationsschüttelkolben zur Untersuchung der AP-3-Toleranz.

Die Gene APASM_1052, APASM_3207, APASM_5765 und APASM_6307, die für ALDH, Asm7, FDTS bzw. dTGD im Stamm ATCC 31280 kodieren, wurden durch PCR unter Verwendung der Primerpaare ALDH-F/R, Asm7-F/R, FDTS-F/R und dTGD amplifiziert -F/R (Ergänzungstabelle 3). Die erhaltenen PCR-Produkte wurden zur Sequenzierungsvalidierung in die EcoRI/HindIII-Stellen des Vektors pET30a eingefügt, und die verifizierten Plasmide wurden zur Proteinexpression in E. coli BL21 eingeführt. Die heterologen Expressionsstämme wurden bei 37 °C und 220 U/min bis zu einer OD600 von 0,8 inkubiert und mit 0,1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und anschließend weitere 10 Stunden bei 16 °C kultiviert. Die Zellen wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 3488 × g (Thermo, TX-750) und 4 °C geerntet und das Pellet anschließend in den entsprechenden Puffern resuspendiert: Tris-HCl-Puffer (300 mM NaCl, 25 mm Tris, pH-Wert). 8,0) für dTGD; HEPES-Puffer (pH 7,5) für FDTS; und Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) für ALDH. Nach 10-minütiger Ultraschallbehandlung auf Eis mit 2 s in 3 s-Intervallen wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 13.800 × g (Thermo Scientific IEC MicroCL 21/21 R) entfernt. und 30 Minuten bei 4 °C gehalten. Anschließend wurde der Überstand auf eine Nickel-NTA-Affinitätschromatographiesäule aufgetragen und mit Resuspensionspuffer, der einen Gradienten von 50–250 mM Imidazol enthielt, eluiert. Der 250 mM Imidazol-Eluent wurde ultrakonzentriert auf 500 µl, und dann wurde Resuspensionspuffer hinzugefügt, um das Imidazol wegzuwaschen, gefolgt von einer erneuten Ultrakonzentrierung auf 500 µl. Die gereinigten Proteine wurden durch SDS-PAGE (ergänzende Abbildung 11) verifiziert und zur Analyse von Protein-AP-3-Wechselwirkungen und enzymkatalytischen Reaktionen verwendet. Die Enzymkonzentration wurde spektrophotometrisch bei 280 nm mit NanoDrop One (Thermo Scientific) bestimmt.

Die biochemischen Reaktionen von dTGD wurden 60 Minuten lang bei 30 °C in 100 μl 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) durchgeführt, der 0,5 μg dTGD und 0,5 mM NAD+ mit unterschiedlichen Konzentrationen an dTDP-D-Glucose als Substrat enthielt (0,1). , 0,16, 0,2, 0,32, 0,48, 0,64 oder 0,8 mM). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μL 1 M NaOH beendet. Das Endprodukt, dTDP-6-Desoxy-D-xylo-4-hexulose, wurde mit einem Mikroplattenlesegerät bei einer Wellenlänge von 320 nm nachgewiesen, um die Reaktion zu überwachen44. Die entsprechenden Km- und Vmax-Werte wurden durch Messung der anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten von dTGD unter verschiedenen Konzentrationen von dTDP-D-Glucose berechnet. Basierend auf dieser Analyseplattform wurden den Reaktionen 0,31 und 0,63 mM AP-3 zugesetzt, um die Hemmkonstanten (KI) von AP-3 für dTGD zu berechnen.

Die Katalysereaktionen von ALDH wurden 60 Minuten lang bei 30 °C in 100 μl 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) durchgeführt, der 2,5 μg ALDH, 100 mM KCl und 2 mM NAD+ mit 0,01, 0,02, 0,04, 0,08 enthielt , 0,12, 0,24, 0,48 oder 0,96 mM Acetaldehyd als Substrat. Anschließend wurden der Mischung 0,1 mM wasserlösliches Tetrazolsalz (WTS-8) und 1 μM 1-Methoxy-5-methylphenaziniummethylsulfat (1-mPMS) zugesetzt, um die Reaktionen abzuschließen. Mit dem Elektronenfänger 1-mPMS kann WTS-8 mit NADH reagieren, um Formazan zu erzeugen. Die Konzentration von Formazan wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 450 nm (A450)45 quantifiziert (ergänzende Abbildung 25). Die Reaktionskonstanten von Km und Vmax wurden anhand der durch ALDH katalysierten Absorption von A450 für verschiedene Acetaldehydkonzentrationen bewertet. Zusätzlich wurden den Reaktionen 0,31 und 0,63 mM AP-3 zugesetzt, um die Hemmkonstanten (KI) von AP-3 für ALDH zu berechnen.

Reaktionen mit FDTS wurden 25 Minuten lang bei 30 °C in 100 μl 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) durchgeführt, der 0,5 μg FDTS, 1 mM MgCl2, 62,5 μM FAD und 0,6 mM NADPH mit 0,1, 0,25, 0,5, 0,75 enthielt. 1, 2, 4 oder 8 μM dUMP als Substrat. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 10 μL 600 μM Ameisensäure gestoppt. Die Reaktionskonstanten von Km und Vmax für FDTS wurden durch den Verbrauch von NADPH zu NADP unter Verwendung einer A340-nm-Detektion46 bestimmt. Zusätzlich wurden den Reaktionen 0,02 und 0,04 mM AP-3 zugesetzt, um die Hemmkonstanten (KI) von AP-3 für FDTS zu berechnen.

Das Oberflächenplasmonresonanz-Biosensor-Analysesystem wurde mit einem Biacore TM 8 K (GE Healthcare) zur Überwachung der biomolekularen Wechselwirkungen bei 25 °C durchgeführt. Der Puffer mit den gereinigten Proteinen wurde mit PBS ausgetauscht, um Störungen des Detektionssignals während des Tests zu verhindern. Anschließend wurden die Proteine mit 10 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,0) auf eine Konzentration von 10 µg/ml verdünnt und dann auf der Oberfläche von CM5-Sensorchips immobilisiert. AP-3 wurde in PBS-Puffer mit 0,5 % DMSO gelöst und auf Gradientenkonzentrationen von 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 μM verdünnt. Während des Bindungsprozesses floss die AP-3-Lösung 90 s lang mit einer Flussrate von 30 μL · min-1 über die CM5-Oberfläche in PBS-Puffer. Anschließend wurde im Dissoziationsschritt PBS-Puffer 120 s lang mit einer Flussrate von 30 μL · min−1 über die Oberfläche von CM5 geleitet, um AP-3 zu eluieren. Für jedes gereinigte Protein wurden Reaktionssignale aus Experimenten mit Gradientenkonzentrationen von AP-3 aufgezeichnet und die Affinitätskonstante (KD) wurde mit der Biacore Insight Evaluation Software berechnet.

Die Zellmorphologie wurde durch Rasterelektronenmikroskopie (HITACHI S340II) charakterisiert. Die geernteten Myzelien wurden dreimal mit 0,1 M PBS-Puffer gewaschen und 12 Stunden lang in 2,5 % Glutaraldehyd (gelöst in PBS-Puffer) fixiert. Fixierte Zellen wurden mit Gradientenkonzentrationen von 5 %, 15 %, 30 %, 60 %, 80 %, 90 %, 95 % und 100 % Ethanollösung (gemischt mit PBS-Puffer) dehydriert, und Ethanol wurde unter Verwendung eines automatischen Trockners für kritische Punkte entfernt (LEICA). Getrocknete Myzelien wurden mit leitfähigem Klebstoff zur Oberflächenvergoldung in einem Vakuumbeschichter (LEICA) auf der Kupferplattform fixiert. Die Bilder wurden mit 10 kfacher Vergrößerung unter dem Rasterelektronenmikroskop aufgenommen. Die Probengröße und -höhe wurde auf 51 mm und 1 mm festgelegt.

Zehn Mikrogramm der rekombinanten His-markierten Proteine ALDH, FDTS und dTGD in 100 μl PBS-Puffer wurden mit 10 μM QG-YNE 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von 20 Minuten langer UV-Bestrahlung mit 365 nm auf Eis. QG-YNE-markierte Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, weiter extrahiert und in 50 mM NH4HCO3-Puffer gelöst. Eine chemische Modifikation durch 60-minütiges Reduzieren mit 20 mM Dithiothreitol bei 60 °C und 30-minütiges Alkylieren mit 50 mM Iodacetamid bei 30 °C wurde durchgeführt, um die Disulfidbindungen zu reduzieren und eine offene Konformation der Proteine zu erzeugen47. Anschließend wurden die Proben 12 Stunden lang mit 2 μg Trypsin (Thermo Scientific) bei 37 °C verdaut, um Peptidfragmente zu erzeugen. Die Peptidfragmentproben wurden mit Ziptip-Entsalzungssäulen (Pierce) entsalzt und nach dem Trocknen durch Verdampfen in 10 μl ddH2O mit 0,1 % Ameisensäure resuspendiert. Die endgültigen Proben wurden mit einem proteomischen Massenspektrometer Thermo Easy nLC1200/Q Exactive plus analysiert, um die von der Photoaffinitätssonde gebundenen Aminosäurereste zu identifizieren.

Nach drei Tagen Fermentation wurden die Myzelien geerntet und die intrazellulären Metaboliten quantitativ analysiert. Konkret wurden 25 ml Fermentationsbrühe gesammelt und bei 6200 × g (Thermo, F15-6 × 100y) zentrifugiert. für 12 Min. Die Myzelien wurden dreimal mit 25 ml PBS-Puffer gewaschen. Anschließend wurden die gewaschenen Myzelien in 25 ml destilliertem Wasser resuspendiert und gleichmäßig auf 5 Röhrchen aufgeteilt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 13.800 × g (Thermo Scientific IEC MicroCL 21/21 R). für 5 min und Entfernen des Überstands. Dann wurden 2,5 ml Extraktionslösung mit 45 % Acetonitril, 45 % Methanol und 10 % Eisessig zugegeben, und das Zellpellet wurde resuspendiert und 15 Minuten lang mit Ultraschall behandelt. Nach zwei Extraktionen wurde die kombinierte Mischung bei 13.800 × g zentrifugiert (Thermo Scientific IEC MicroCL 21/21 R). 5 Minuten lang inkubiert und der Überstand durch einen 0,22-µm-Filter filtriert und zur Analyse der intrazellulären Metaboliten gesammelt. Alle oben genannten Schritte wurden bei 4 °C oder auf Eis durchgeführt.

Die quantitative Analyse von Acetyl-CoA wurde unter Verwendung eines LC-MS 1260-QQQ 6470 (Agilent) mit einer Eclipse-C18-Säule (4,6 × 250 mm, 5 μm, Agilent) bei einer Flussrate von 0,5 ml/min mit einem 2 μL Injektionsvolumen. Die mobile Phase bestand aus (A) 20 mM Ammoniumacetat in Milli-Q-Wasser mit einem pH-Wert von 7,4 und (B) Methanol. Die Metaboliten wurden durch die mobile Gradientenphase wie folgt eluiert: 0–5 Minuten, 2 % B; 5–15 Min., 2 % B bis 50 % B; 15–20 Min., 90 % B; 20–25 Min., 90 % B bis 2 % B; und 25–30 Minuten, 2 % B. Die quantitative Analyse von Zitronensäure, Isozitronensäure und dTMP wurde mit einem ACQUITY UPLC H-Class-System und einem Xevo TQ-XS Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (Waters, Milford, MA, USA) mit ACE durchgeführt Excel C18-PFP (100 × 2,1 mm, 1,7 μm, Phenomenex) bei einer Flussrate von 0,3 ml/min mit 1 μL Injektionsvolumen. Wasser und Acetonitril, beide enthalten 0,1 % Ameisensäure, wurden als mobile Phasen A bzw. B mit einem linearen Gradienten von 1–100 % B innerhalb von 10 Minuten verwendet.

Metaboliten wurden im MRM-Modus (Multiple Reaction Monitoring) mit einer Rate von 0,01 s/Scan und einer auf 1 kV eingestellten Kapillarspannung gescannt. Die Quellentemperatur wurde bei 150 °C gehalten, während die des Desolvatisierungsgases 450 °C betrug. Die Durchflussraten des Desolvatisierungsgases (Stickstoff) und des Kegelgases (Argon) betrugen 900 bzw. 50 l/h. Acetyl-Coenzym A wurde im Positivionen- und MRM-Modus nachgewiesen. dTMP, Zitronensäure und Isozitronensäure wurden im Negativionen- und MRM-Modus nachgewiesen. Die Kalibrierungskurven und das quantitative MRM-Signal zur Quantifizierung von dTMP sind in der ergänzenden Abbildung 21 dargestellt. für Acetyl-CoA in der ergänzenden Abbildung 26; für Zitronensäure und Isozitronensäure in der ergänzenden Abbildung 27. Die Kegelspannung (V) und die Kollisionsenergie (eV) von Acetyl-CoA, Zitronensäure, Isozitronensäure und dTMP wurden auf 20/15, 20/15, 20/ eingestellt. 20 bzw. 15/20.

Die Proteinmodellierung wurde mit AlphaFold v2.1.148 und rank_0.pdb durchgeführt, die die Vorhersage mit der höchsten Zuverlässigkeit enthielt und für die weitere Analyse ausgewählt wurde. Alle Proteine wurden sowohl im Monomerformat als auch im Homomultimerformat modelliert. Zur Bestimmung der Oligozustände wurden Aminosäuresequenzen von ALDH, FDTS und dTGD zum Durchsuchen der PDB-Datenbank (https://www.rcsb.org/) verwendet und homologe Proteine analysiert. ALDH wurde mit einer Sequenzidentität von 43 % an 5gtl angeglichen, was ein Homotetramer bildet. FDTS und dTGD wurden an 3hzg und 1r66 ausgerichtet, die ein Homotetramer bzw. Homodimer mit Sequenzidentitäten von 72 % bzw. 70 % bilden. Proteinstrukturen wurden mit PyMol (Version 2.3.0)49 analysiert.

Die Molekülstruktur von AP-3 wurde aus der PDB-Datenbank (PDB-ID: 7e4p) erhalten. AutoDock Tools50 wurde verwendet, um Protein- und Moleküldateien mit hinzugefügten polaren Wasserstoffatomen in pdbqt umzuwandeln. Das molekulare Docking wurde von AutoDock Vina 1.2.351 mit AP-3 und Zielproteinen als Ligand bzw. Rezeptoren durchgeführt. Gleichzeitig wurde die Vollständigkeit des Arguments auf 32 gesetzt, um ein zuverlässigeres Andockergebnis zu erhalten. Die Bindungsstellen von AP-3 wurden mit PyMol (Version 2.3.0) visualisiert. Die Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen und hydrophoben Wechselwirkungen zwischen AP-3 und Proteinen wurden mit LigPlot+ (Version v2.2.5)52 analysiert (Ergänzende Abbildungen 14, 19 und 24).

Für die statistische Analyse von Biomasse, Myzellänge, AP-3-Titer und Konzentrationen intrazellulärer Metaboliten wurde ein Einweg-ANOVA-Test durchgeführt. P ≥ 0,1, P < 0,1, P < 0,05 und P < 0,01 wurden als unbedeutend, signifikant, mäßig signifikant bzw. hoch signifikant definiert. Die CONFIDENCE.T-Formel in Excel wurde verwendet, um das 95 %-Konfidenzintervall des Mittelwerts zu schätzen. Cohens d wurde verwendet, um die Effektgröße des Mittelwerts zu berechnen. Für die Experimente zur Biomassemessung und Metabolitenquantifizierung wurden drei unabhängige biologische Replikate verwendet, während für die Myzellängenmessung fünf Proben ausgewählt wurden. Die Auswirkungen von AP-3 und der Sonde QG-YNE auf die Wachstumsrate des Hefe-Indikatorstamms wurden einmal gemessen. Die Wechselwirkungen zwischen AP-3 und Desoxythymidindiphosphat-Glucose-4,6-Dehydratase (dTGD), Flavin-abhängiger Thymidylat-Synthase (FDTS) und Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH) wurden einmal gemessen. Bei der Michaelis-Menten-Konstantmessung von drei Zielproteinen wurden drei unabhängige biologische Replikate verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar. Die in diesem Artikel generierten und analysierten Datensätze sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die den Grafiken und Proteomdiagrammen zugrunde liegenden Quelldaten werden als Ergänzungsdaten 1 und 2 hochgeladen. Die Sequenzen für alle in diesem Manuskript beschriebenen Gene sind in den GenBank-Datenbanken unter den Zugangsnummern CP073249.1 verfügbar. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD043867 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.

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Referenzen herunterladen

Wir widmen dieses Papier dem Gedenken an unseren verstorbenen Kollegen, Prof. Youli Xiao. Wir würdigen die frühen Bemühungen von Youli Xiao, die Photoaffinitätssonde zu synthetisieren und die chemoproteomische Analyse durchzuführen. Wir freuen uns über die hilfreichen Kommentare von Prof. Shenying Li von der Shandong University und Prof. Ningyi Zhou von der SJTU. Wir danken dem Core Facility and Technical Service Center für SLSB und dem Instrumental Analysis Center in SJTU für die Datenerfassung. Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (Zuschuss-Nr. 2021YFC2100600 und 2019YFA0905400), der National Natural Science Foundation of China (Zuschuss-Nr. 31830104) und der Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (Zuschuss-Nr. 19JC1413000 und) unterstützt 19430750600) an LB

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Qianjin Kang, Linquan Bai.

Staatliches Schlüssellabor für mikrobiellen Stoffwechsel, Gemeinsames Innovationszentrum für antibakterielle Resistenzen Shanghai-Islamabad-Belgrad, Fakultät für Biowissenschaften und Biotechnologie, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, China

Qungang Huang, Xin Zhang, Ziyue Guo, Xinnan Fu, Yilei Zhao, Qianjin Kang und Linquan Bai

Gemeinsames internationales Forschungslabor für Stoffwechsel- und Entwicklungswissenschaften, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, China

Qungang Huang, Xin Zhang, Ziyue Guo, Xinnan Fu, Yilei Zhao, Qianjin Kang und Linquan Bai

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LQB und QGH haben das Projekt konzipiert. LQB, QJK und QGH haben die Experimente entworfen. QGH, XZ, XNF und ZYG führten die Experimente durch. QGH, QJK, YLZ und LQB analysierten die Daten. QGH, QJK, YLZ und LQB haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Qianjin Kang oder Linquan Bai.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Zhiqiang Cai, Constance B. Bailey und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: [Tobias Goris und Anam Akhtar]. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Huang, Q., Zhang, X., Guo, Z. et al. Durch die Biosynthese von Ansamitocin P-3 wird der produzierende Stamm Actinosynnema pretiosum an mehreren Zielen gestresst. Commun Biol 6, 860 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05227-w

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Eingegangen: 26. April 2023

Angenommen: 07. August 2023

Veröffentlicht: 18. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05227-w

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