Withania somnifera (L.) Dunal ganz | Gansu-Lagertankgruppe

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 11047 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Withania somnifera (L.) Dunal (Ashwagandha) wird aufgrund seiner therapeutischen Anwendung bei zahlreichen Beschwerden häufig in den Arzneimittelsystemen Ayurveda, Unani und Siddha verwendet. Traditionell werden aus der Pflanze hergestellte Medikamente nur aus ihren Wurzeln hergestellt, und basierend auf der derzeit verfügbaren wissenschaftlichen Literatur ist ihre Wirksamkeit und Sicherheit gut belegt. Neben den Wurzeln enthalten auch die oberirdischen Teile bioaktive Bestandteile und entsprechend werden in bestimmten handelsüblichen Präparaten auch die Blätter der Pflanze eingesetzt. Dementsprechend hat das Ministerium für Ayush der indischen Regierung kürzlich eine Empfehlung herausgegeben, in der die Notwendigkeit einer umfassenden Wirksamkeits- und Sicherheitsprofilierung von Produkten auf Blattbasis betont wird. Aus diesem Grund haben wir die vorliegende GLP-gesteuerte Studie durchgeführt, in der die nichtklinische Sicherheit eines hydromethanolischen Extrakts der gesamten Pflanze von Withania somnifera (WSWPE) gemäß der OECD-Richtlinie 407 bewertet wurde. In dieser Studie wurden Sprague-Dawley-Ratten von beidem untersucht Geschlecht wurden WSWPE an 28 aufeinanderfolgenden Tagen in Dosen von 100, 300 und 1000 mg/kg/Tag oral verabreicht. Die Studie umfasste auch eine Satellitengruppe von Tieren, die 28 Tage lang WSWPE erhielten, gefolgt von einer 14-tägigen Erholungsphase. Der Gesamtpflanzenextrakt von Withania somnifera erwies sich bis zu einer Dosis von 1000 mg/kg/Tag als sicher, da keine toxikologisch relevanten Befunde festgestellt werden konnten.

Withania somnifera (L.) Dunal (Hindi: Ashwagandha, Englisch: Winterkirsche) gehört zur Familie der Solanaceae und wird im Ayurveda zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Historisch gesehen reicht seine Präsenz als Standard-Heilkraut in den indischen Arzneimittelsystemen Jahrtausende zurück1. Traditionell werden die getrockneten Wurzeln des Krauts zur Herstellung klassischer ayurvedischer Rezepturen verwendet, und die moderne Wissenschaft hat seine wohltuende Wirkung auch durch evidenzbasierte Forschung bestätigt, die sich auf die Entschlüsselung seines pharmakologischen Wirkmechanismus konzentriert. Die pharmakologische Aktivität von Withania somnifera wird auf das Vorhandensein mehrerer bioaktiver Sekundärmetaboliten in den Wurzeln zurückgeführt2. In präklinischen Studien hat eine Vielzahl von aus den Wurzeln hergestellten Extrakten krebshemmende, immunmodulatorische, kardioprotektive, neuroprotektive, antioxidative, Anti-Aging-, adaptogene und antidiabetische Wirkungen gezeigt3. Im Hinblick auf seine neuroprotektive Aktivität verbesserte die orale Verabreichung von Withania somnifera in einem Tiermodell der Parkinson-Krankheit den Katecholamingehalt im Striatum und regulierte die Dopamin-D2-Rezeptoren im Striatum2. Diese biologischen Aktivitäten haben sich erfolgreich in nachweisbaren klinischen Wirksamkeiten bei einer Reihe von Erkrankungen wie Hypothyreose, Schizophrenie, Zwangsstörungen, Stress, Angstzuständen, Schlaflosigkeit, kognitiven Beeinträchtigungen, Typ-2-Diabetes mellitus und männlicher Unfruchtbarkeit niedergeschlagen3.

Während getrocknete Wurzeln oder Extrakte hauptsächlich für therapeutische Zwecke verwendet werden, kommen bei bestimmten rezeptfreien Formulierungen zusätzlich Formulierungen auf Blattbasis zum Einsatz. Bezüglich der Verwendung solcher vermarkteter Produkte wurde kürzlich von der Abteilung für Arzneimittelpolitik des Ministeriums für AYUSH der indischen Regierung eine Empfehlung herausgegeben, in der es heißt, dass derzeit ein dringender Bedarf an substanziellen Beweisen und wissenschaftlicher Literatur besteht, die die Wirksamkeit eindeutig belegen kann und Sicherheit von Formulierungen, die aus den Blättern von Withania somnifera4 hergestellt werden. Die Generierung präziser und qualitativ hochwertiger Daten würde anschließend den Weg für die behördliche Akzeptanz der aus den Blättern gewonnenen Formulierungen ebnen und so deren therapeutischen Einsatz vorbehaltlos ermöglichen. Dementsprechend berichten wir unter Berücksichtigung dieser klar definierten Richtlinien der Aufsichtsbehörden zum ersten Mal über eine GLP-gesteuerte nichtklinische Sicherheitsbewertung eines Extrakts, der aus der gesamten Pflanze von Withania somnifera, einschließlich der Blätter und der anderen Antennen, hergestellt wurde Teile.

Es ist unbedingt zu verstehen, dass die aus Blättern und Stängeln5, Beeren6 und den Samen von Withania somnifera7 hergestellten Extrakte neben den Wurzeln mehrere bioaktive Komponenten enthalten, die zusätzlich zu den Wurzeln präklinische pharmakologische Aktivitäten mit potenziellen klinisch-therapeutischen Anwendungen gezeigt haben. Daher verdienen neben den Wurzeln auch die oberirdischen Pflanzenteile einer weiteren klinischen Untersuchung.

Die präklinische und klinische Sicherheit der Wurzelpräparate wurde ausführlich untersucht. Die nichtklinischen Sicherheitsbewertungsstudien haben ein akzeptables Sicherheitsprofil der Withania somnifera-Wurzel ergeben. Verschiedene Studien zur akuten, subakuten, subchronischen und chronischen Toxizität haben effektiv bestätigt, dass die Wurzelextrakte bei oraler Verabreichung, was bei Menschen beabsichtigt ist, bei Versuchstieren sicher sind1. Ebenso gibt es in der veröffentlichten Literatur ausreichende Beweise für eine angemessene klinische Sicherheit der Wurzelpräparate, und bisher wurden keine ernsthaften Sicherheitsbedenken, einschließlich einer Veränderung der Vitalfunktionen sowie hämatologischer und klinisch-chemischer Parameter, gemeldet. Bei klinischen Studien sind alle gemeldeten unerwünschten Ereignisse leicht bis mittelschwer und vorübergehender Natur. Berichten zufolge ist die Zahl der Studienabbrüche aufgrund von unerwünschten Ereignissen vernachlässigbar1.

Unserer Ansicht nach erwarten wir aufgrund der Ähnlichkeit der bioaktiven Sekundärmetaboliten, die sowohl in den Wurzeln als auch in den oberirdischen Teilen der Pflanze vorhanden sind, ein vergleichbares Sicherheitsprofil zwischen der Wurzel und dem gesamten Pflanzenextrakt. Mit dem Ziel, die langfristige Sicherheitsbewertung bei Nagetieren, die Sicherheitsbewertung bei Nicht-Nagetieren und den voraussichtlichen klinischen Nutzen von Withania somnifera Whole Plant Extract (WSWPE) zu unterstützen, haben wir daher seine nichtklinische Sicherheit in Übereinstimmung mit der Organization for Economic bestimmt Richtlinie für Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) 4078 und in Übereinstimmung mit den OECD-Grundsätzen für gute Laborpraxis (GLP). In der vorliegenden Studie wurde WSWPE über einen Zeitraum von insgesamt 28 Tagen wiederholt oral an Sprague-Dawley-Ratten beiderlei Geschlechts verabreicht. Unser Studiendesign umfasste auch einen Satellitenarm von Tieren, denen 28 Tage lang die höchste Dosis des Extrakts oral verabreicht wurde und die dann weitere 14 behandlungsfreie Tage lang beobachtet wurden, um die Persistenz, Reversibilität oder die verzögerte Manifestation von Nebenwirkungen zu bewerten . Das Hauptziel der Studie bestand darin, Hinweise auf jegliche extraktbedingte größere Toxizität zusammen mit den beteiligten Zielorganen und dem No-Observed-Adverse-Effect-Level (NOAEL) von WSWPE bei Ratten zu liefern. Nach unserem Kenntnisstand ist dies der erste Bericht, der die nichtklinische Sicherheitsbewertung des gesamten Pflanzenextrakts von Withania somnifera beschreibt.

Die gesamte Pflanze von Withania somnifera (L.) Dunal wurde im Kräutergarten des Patanjali Research Institute, Haridwar, Indien, gesammelt und bestand aus Wurzeln, Stängeln, Blättern, Beeren und Samen in natürlichem Verhältnis. Die gesamte Pflanze von Withania somnifera wurde unter Einhaltung der Vorschriften gesammelt mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien. Die Echtheit der Pflanzenprobe wurde vom Council of Scientific and Industrial Research – National Institute of Science Communication and Information Resources (CSIR–NISCAIR), Neu-Delhi, indische Regierung, anhand der Authentifizierungsgutscheinnummer NISCAIR/RHMD/Consult/2019/3453 zertifiziert -54-15; und Patanjali Research Foundation Herbarium (siehe Zugangsnummer 5606). WSWPE (Chargennummer D4/CHM/SAHA075/1220), ein braun gefärbtes, frei fließendes Pulver, wurde am Patanjali Research Institute, Haridwar, Indien, hergestellt. Eine wässrige Suspension von WSWPE, die den Versuchstieren oral verabreicht werden sollte, wurde unter Verwendung von 0,5 % Methylcellulose als Vehikel formuliert. Alle anderen für das Experiment verwendeten Reagenzien und Chemikalien waren von höchster kommerzieller Qualität.

Etwa 10 kg trockenes gesamtes Pflanzenmaterial von Withania somnifera wurden mit 75 l Wasser:Methanol (1:1 v/v) als Lösungsmittel bei 70–80 °C 4 Stunden lang in einem Extraktor unter Rückflussbedingungen extrahiert. Der Extrakt wurde durch ein 10-Mikron-Filtertuch filtriert. Dieser Vorgang wurde noch einmal wiederholt, um eine vollständige Extraktion sicherzustellen. Das Filtrat wurde gesammelt und in einem Wischfilmverdampfer konzentriert und bei einer Einlasslufttemperatur von 150 °C und einer Zulaufströmungsrate von 10 l pro Stunde sprühgetrocknet. Es wurde ein hell- bis dunkelbraun gefärbtes Pulver mit einer Ausbeute von 11 % auf Trockenbasis erhalten.

Eine WSWPE-Suspension mit einer Konzentration von 100 mg/ml in 0,5 % Methylcellulose wurde unmittelbar nach der Herstellung und nach 24-stündiger Lagerung bei Raumtemperatur auf ihre Bestandteile analysiert. Zur Herstellung der Testlösung wurden 1,0 g der Suspension 10 ml Methanol zugesetzt. Die Lösung wurde dann 5 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert und unter Verwendung eines 0,44-μm-Nylonfilters filtriert. Zu den verwendeten Standards gehörten Withanoside IV und Withanolid A, bezogen von Natural Remedies, Indien. Stammlösungen beider Standards (Konzentration: 1000 µg/ml) wurden durch Auflösen genau abgewogener Standards in Methanol hergestellt. Die Stammlösungen des Standards wurden weiter verdünnt, um 100 µg/ml-Lösungen herzustellen. Die Ultrahochleistungschromatographie (UHPLC)-Analyse wurde mit dem Prominence-XR UHPLC-System (Shimadzu, Japan) durchgeführt, das mit einem Fotodiodenarray-Detektor ausgestattet war. Ein Gradientenlösungsmittelsystem aus Lösungsmittel A: hergestellt durch Auflösen von 0,14 g Kaliumdihydrogenphosphat in 900 ml Wasser unter Zugabe von 0,5 ml Orthophosphorsäure und anschließendes Verdünnen auf 1000 ml mit Wasser; und Lösungsmittel B: Acetonitril wurde verwendet. Das während der Analyse verwendete Gradientenelutionsprogramm bestand aus 5 bis 45 % B für 0 bis 18 Minuten, 45 bis 80 % B für 18 bis 25 Minuten, 80 % B für 25–28 Minuten, 80 bis 5 % B für 28 bis 30 Minuten , 5 % B von 30 bis 40 Min. Für die chromatographische Trennung wurde der Shodex C18 4E (5 µm, 4,6 × 250 mm) (Shodex, Japan) mit einer Flussrate von 1,5 ml/min verwendet. Der chromatographische Nachweis aller Analyten erfolgte mit einem PDA-Detektor bei 227 nm. Die Temperatur der Säule wurde bei 27 °C gehalten und das Probeninjektionsvolumen betrug 20 µL.

Die Identifizierung der Analyten erfolgte auf der Grundlage der relativen Retentionszeit (RRT), wobei der Withanolid-A-Peak als Referenz diente und als 1,0 RRT betrachtet wurde, während 0,70, 0,75, 0,80, 0,89, 0,89, 0,92, 0,96, 1,01 und 1,14 waren RRT von Withanosid IV, Physagulin D, 27-Hydroxywithanon, Withanosid V, Withaferin A, 12-Desoxywithastramonolid, Withanon bzw. Withanolid B.

Die Konzentration der einzelnen Analyten in der WSWPE-Suspension wurde entsprechend ihrer Kategorie berechnet, nämlich Withanolid-Aglykone und Withanolid-Glykoside. Withanolid-Aglykone, einschließlich Withaferin A, 12-Desoxywithastramonolid, Withanolid A, Withanon und Withanolid B, wurden anhand der Withanolid-A-Standardprobe berechnet, während Withanolid-Glykoside (Withanoside IV, Withanoside V und Withanoside VI) anhand der Withanoside-IV-Standardprobe berechnet wurden.

Die nichtklinische Sicherheitsbewertung von WSWPE wurde bei der Preclinical Research and Development Organization (PRADO), Private Limited, Pune, Indien, durchgeführt. Die Testeinrichtung ist von der National GLP Compliance Monitoring Authority (NGCMA), Department of Science & Technology, Government of India, zertifiziert (GLP/C-127/2018; GLP/C-168/2021); und vom Ausschuss für den Zweck der Kontrolle und Überwachung von Tierversuchen (CPCSEA; Registrierungsnummer: 1723/PO/RcBiBt/S/13/CPCSEA), Abteilung für Tierhaltung und Milchwirtschaft, Ministerium für Fischerei, Tierhaltung und Milchwirtschaft, Indische Regierung. Für die Durchführung der Studie wurde PRADO ein codierter Testgegenstand zur Verfügung gestellt, und daher wurde die Bewertung der nichtklinischen Sicherheit von WSWPE blind in der Testeinrichtung durchgeführt.

Männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (6–8 Wochen alt) wurden vom National Institute of Bioscience, Pune, Indien (CPCSEA-Registrierungsnummer: 1091/GO/Bt/S/07/CPCSEA) bezogen. Einer Gruppe zugeordnete Ratten wurden gemeinsam in individuell belüfteten Käfigen (Optirat® Plus, Animal Care Systems, Inc., USA; Käfigabmessungen: 41 cm × 41 cm × 78 cm) mit sterilisierten Maiskolben als Einstreumaterial untergebracht. Die Temperatur im Versuchstierraum wurde zwischen 20,6 und 22,7 °C gehalten, während die relative Luftfeuchtigkeit zwischen 40 und 62 % schwankte. Der Luftwechsel im Tierraum lag zwischen 10 und 15 pro Stunde und die Photoperiode war ein 12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus. Den Tieren wurde pelletiertes Labortierfutter (Nutrivet Lifescience, Indien) ad libitum angeboten, das mit ultraviolettem Licht sterilisiert wurde. Zusätzlich wurde ihnen mit ultraviolettem Licht bestrahltes und durch Umkehrosmose gereinigtes Trinkwasser in dampfsterilisierten Polypropylenflaschen zugeführt. Nach Erhalt der Versuchstiere vom Lieferanten wurden die Ratten in einen Quarantäneraum gebracht, wo sie für einen Zeitraum von fünf Tagen untergebracht wurden.

Die experimentellen Verfahren und Tierhaltungspraktiken entsprachen strikt den CPCSEA-Standards9 und die Genehmigung des Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) des Studienstandorts lag vor Beginn der Studie vor (siehe Protokollnummer: IAEC-20–068). . Darüber hinaus wurde die Studie in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien10 durchgeführt.

Die nichtklinische Sicherheitsbewertung von WSWPE wurde gemäß der OECD-Testrichtlinie Nr. 407 durchgeführt.

Nach Ablauf der Quarantänezeit wurden 32 männliche bzw. 32 weibliche Tiere von der Tierversuchseinrichtung zugeteilt. Anschließend wurden die Tiere in einen für die Studie vorgesehenen Versuchsraum gebracht, wo sie sich für weitere fünf Tage akklimatisierten. Während der Akklimatisierungsphase wurden die Ratten durch Markierungen an den Schwanzspitzen unterschieden.

Die Tiere wurden einer umfassenden klinischen Untersuchung unterzogen und anschließend mit einer Tierwaage gewogen. Anschließend wurden 30 männliche und 30 weibliche Tiere auf der Grundlage ihres Körpergewichts, wie in der ergänzenden Abbildung S1 angegeben, zufällig den Studiengruppen zugeordnet. Alle Studiengruppen bestanden aus fünf männlichen und fünf weiblichen Ratten. Den Tieren wurde eine dauerhafte Tiernummer zugewiesen und am Schwanzansatz markiert. Zu Beginn des Experiments betrug die Schwankung des Körpergewichts der Tiere beiderlei Geschlechts nicht mehr als ± 20 % des Durchschnittsgewichts. Im Anschluss an die Randomisierung wurden die Versuchstiere einer ophthalmoskopischen Untersuchung mit einem Ophthalmoskop unterzogen und anschließend eine Mydriasis mit 1 % Tropicamid-Lösung induziert.

WSWPE wurde gewogen und dann in einen Mörser gegeben. Anschließend wurde es mit einem Stößel verrieben und anschließend unter ständigem Mischen eine kleine Menge 0,5 % Methylcellulose (Loba Chemie Private Limited, Indien) zugegeben. Anschließend wurde unter ständigem Rühren das restliche Volumen des Vehikels zugetropft, um eine homogene Suspension zu erhalten. Alle Formulierungen wurden während der gesamten Verabreichungsphase der Verbindung frisch zubereitet.

Den Ratten der Gruppen G2 (niedrige Dosis), G3 (mittlere Dosis), G4 (hohe Dosis) und G4R (hohe Dosis-Erholung) wurde eine Dosis von 100, 300, 1000 bzw. 1000 mg/kg/Tag oral verabreicht Route. Kontrolltiere aus dem Haupt- (G1) und dem Erholungsarm (G1R) erhielten 0,5 % Methylcellulose. Das Dosisvolumen wurde auf 10 ml/kg Körpergewicht festgelegt.

Die Tiere wurden einmal täglich auf die Entwicklung klinisch abnormaler Anzeichen und zweimal täglich auf Anzeichen von Morbidität oder das Auftreten von Mortalität überwacht. Nach Beendigung der Vehikel-/Extraktverabreichungsphase wurde die Beobachtungsdauer für Tiere, die dem Erholungsarm (G1R bzw. G4R) zugeordnet waren, um weitere 14 Tage verlängert. Die klinischen Symptome wurden hinsichtlich ihres Beginns, ihrer Schwere, ihrer Dauer und ihrer Reversibilität erfasst. In beiden Studienarmen wurden die Ratten bis zum Ende des Experiments einmal pro Woche auf detaillierte klinische Beobachtungen hin untersucht. Die Untersuchungen umfassten Veränderungen an Haut, Fell, Augen und Schleimhäuten, das Auftreten von Sekreten und Ausscheidungen sowie grundlegende Beobachtungen der autonomen Aktivität8.

Für den Hauptstudienarm wurden die Tiere am 1., 8., 15., 22. und 28. Tag gewogen. Im Erholungsarm wurden die Ratten außerdem an den Tagen 35 und 42 gewogen. Darüber hinaus wurde das Nüchternkörpergewicht der Tiere im Haupt- und Erholungsarm auch am Tag der Autopsie dokumentiert.

Die Nahrungsaufnahme in verschiedenen Studiengruppen wurde einmal pro Woche erfasst. Der Pro-Kopf-Lebensmittelverbrauch für eine Woche wurde mithilfe der folgenden Formel ermittelt:

Ratten aus dem Hauptstudienarm, denen das Vehikel (G1) und die hohe Dosis WSWPE (G4) verabreicht wurden, wurden in der vierten Woche der Studie auf etwaige extraktbedingte Augenanomalien untersucht. Mydriasis wurde bei den Tieren mit 1 % Tropicamid-Lösung induziert, woraufhin beide Augen mit einem Ophthalmoskop beobachtet wurden. Diese Untersuchung wurde bei Tieren, die die niedrige und mittlere Dosis des Extrakts erhielten, nicht durchgeführt, da keine WSWPE-bedingten Veränderungen beobachtet wurden bei hochdosierten Gruppentieren.

Am 28. und 42. Tag wurden die Tiere, die im Haupt- bzw. Erholungsarm unterschiedlichen Gruppen zugeordnet waren, über Nacht gefastet. Anschließend wurde an den Tagen 29 und 43 den Ratten unter vorübergehender Isoflurananästhesie Blut aus den retroorbitalen Nebenhöhlen entnommen, um die Wirkung von WSWPE auf die Parameter Hämatologie, Gerinnung und klinische Chemie zu bewerten.

Das Blut wurde in Fläschchen abgegeben, die Ethylendiamintetraessigsäure und Dikaliumsalz als Antikoagulans enthielten. Nach ordnungsgemäßem Mischen wurde das Blut in einem Sysmex XP-100 Auto-Analysator (Sysmex Corporation, Japan) abgesaugt und die folgenden Parameter quantifiziert: Anzahl roter Blutkörperchen (RBC), Hämatokrit (HCT), mittleres Korpuskularvolumen (MCV), Hämoglobin (HGB), mittleres korpuskuläres Hämoglobin (MCH), mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC), Thrombozytenzahl (PLT) und weiße Blutkörperchen (WBC). Die differenzielle Leukozyten- und Retikulozytenzählung wurde manuell an Blutausstrichen durchgeführt, indem diese mit Giemsa- bzw. New Methylenblau-Färbung gefärbt wurden.

Vollblut wurde in mit Natriumcitrat versetzten Röhrchen gesammelt. Die Prothrombinzeit (PT) und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) wurden mit dem Koagulationsanalysator Erba ECL-105 (Erba Mannheim, Deutschland) ermittelt.

Das Blut wurde zur Plasmatrennung in Fläschchen mit Heparin bzw. zur Serumtrennung in Röhrchen ohne Antikoagulans überführt. Plasma und Seren wurden durch Zentrifugation (3000 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten) gewonnen. Die Seren wurden zur Elektrolytanalyse verwendet, d. h. Natrium (Na+), Kalium (K+) und Chlorid (Cl−) unter Verwendung eines Sensacore-Elektrolytanalysators ST-200CL (Sensacore, Indien). Die Plasmaproben wurden zur Schätzung der folgenden Parameter unter Verwendung eines Erba EM Destiny 180 Auto Analysegeräts (Erba Mannheim, Deutschland) verwendet: Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT oder AST), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT oder ALT), alkalische Phosphatase (ALP), Gesamtbilirubin (BILT), Blutharnstoffspiegel (BUL), berechneter Blutharnstoffstickstoff (BUN), Kreatinin (CREAT), Glukose (GLU), Gesamtcholesterin (CHOLE), Gesamtprotein (PRO), Albumin (ALB ) und Protein:Albumin-Verhältnis (PAR).

Qualitative Urinanalyseparameter wurden in Nachturinproben aller Tiere gemessen, die den verschiedenen Gruppen sowohl im Haupt- als auch im Erholungsarm während der letzten Woche der Behandlungs- bzw. Erholungsphase zugeteilt wurden, indem Stoffwechselkäfige für die Urinsammlung und der Urinanalysator Erba LAURA SMART eingesetzt wurden (Erba Mannheim, Deutschland) zur Analyse. Die ausgewerteten Parameter waren: Bilirubin (BIL), Glucose (GLU), Protein (PRO), pH und spezifisches Gewicht (SG). Zusätzlich wurde der Urin manuell auf seine Farbe und Klarheit untersucht.

Die Tiere wurden durch Erstickung durch Kohlendioxid auf humane Weise eingeschläfert. Alle Ratten wurden einer umfassenden makroskopischen pathologischen Untersuchung unterzogen, die eine umfassende Untersuchung der äußeren Körperoberfläche, aller Körperöffnungen sowie der Schädel-, Brust- und Bauchhöhlen mit ihrem Inhalt umfasste8.

Nach groben pathologischen Beobachtungen wurden Leber, Nieren, Nebennieren, Hoden/Eierstöcke, Thymusdrüse, Milz, Gehirn und Herz aller Tiere herauspräpariert und beschnitten, um jegliches anhaftende Gewebe zu entfernen. Anschließend wurde ihr Nassgewicht notiert und alle gepaarten Organe gemeinsam gewogen. Die zum Wiegen ausgewählten Organe wurden dann in 10 % neutral gepufferte Formalinlösung überführt, mit Ausnahme der Hoden, die in modifiziertem Davidson-Fixiermittel fixiert wurden. Das relative Organgewicht, ausgedrückt als Prozentsatz des nüchternen Körpergewichts, wurde dann für jedes einzelne Tier unter Verwendung der folgenden Formel berechnet :

Die folgenden Organe wurden ebenfalls von allen Tieren entnommen und für die anschließende mikroskopische Untersuchung in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert: Aorta, Knochen (Knochenmark), Großhirn, Kleinhirn, Mittelhirn, Nebenhoden, Speiseröhre, Dickdarm, Lunge, Lymphknoten (Mesenterium). ), Bauchspeicheldrüse, Ischiasnerv, Hypophyse, Samenbläschen, Prostata, Skelettmuskel, Haut, Dünndarm, Magen, Rückenmark, Schilddrüse und Nebenschilddrüse, Luftröhre, Harnblase, Vagina, Gebärmutter und Brustdrüsen. Zur Fixierung der Augen wurde Modified Davidson's Fixative verwendet.

Die fixierten Organe der Tiere, die Vehikel (G1) und die Hochdosisgruppe (G4) von WSWPE aus dem Hauptstudienarm erhielten, wurden standardmäßigen Gewebeverarbeitungsverfahren unterzogen. Anschließend wurden die Gewebe mithilfe einer Gewebeeinbettungsstation in Paraffin eingebettet. Anschließend wurden mit einem Mikrotom Gewebeschnitte mit einer Dicke von 3–5 µm gewonnen und diese Schnitte weiter mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Die gefärbten Schnitte wurden anschließend unter Verwendung eines Mikroskops auf beobachtete mikroskopische Veränderungen untersucht.

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung aller Gruppen ausgedrückt und mit Graph Pad Prism (Version 7.03) statistisch analysiert. Für den Hauptstudienarm wurden die Parameter Körpergewicht, Hämatologie, Gerinnung, Biochemie, Urinanalyse (spezifisches Gewicht und Urin-pH) und relative Organgewichte mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA analysiert. Als sich herausstellte, dass die ANOVA statistisch signifikant war, wurde der Mehrfachvergleichstest von Dunnett als Post-hoc-Test eingesetzt, um die Gruppen zu ermitteln, die sich auf dem 5 %-Niveau, d. h. p < 0,05, signifikant von den Gruppen unterschieden, denen das Vehikel verabreicht wurde. Für den Erholungsarm wurden die oben genannten Parameter mithilfe des Student-t-Tests auf einen signifikanten Unterschied von 5 % zwischen der Gruppe, die das Vehikel (G1R) erhielt, und der Gruppe, die die hohe Dosis WSWPE (G4R) erhielt, analysiert.

Wie in Abb. 1 dargestellt, zeigt das UHPLC-Chromatogramm, dass die formulierte Suspension von WSWPE, die zur oralen Verabreichung an Ratten bestimmt ist, aus Withanosid IV, Withaferin A, 12-Desoxywithastramonolid, Withanolid A, Withanon, Withanolid B, Withanosid V und VI besteht. Berichten zufolge kommen diese in der Suspension nachgewiesenen Phytobestandteile in Withania somnifera2 vor, was den Extrakt chemisch eindeutig charakterisiert.

UHPLC-Chromatogramm der Phytobestandteile in einer WSWPE-Suspension, hergestellt unter Verwendung von 0,5 % Methylcellulose, sofort (A) und nach 24-stündiger Lagerung bei Raumtemperatur (B).

Die Konzentrationen von Withanosid IV im Anfangsstadium und 24 Stunden nach Halten der Suspension bei Raumtemperatur betrugen 0,122 mg/ml bzw. 0,106 mg/ml (Ergänzungstabelle S1). Darüber hinaus betrug die Konzentration von Withaferin A zu beiden oben genannten Zeitpunkten 0,257 bzw. 0,211 mg/ml (Ergänzungstabelle S1). Die Konzentration der gesamten Withanolide in der Suspension betrug unmittelbar nach der Zubereitung 0,885 mg/ml und nach 24 Stunden 0,735 mg/ml (Ergänzungstabelle S1). Folglich war WSWPE im Vehikel bei Raumtemperatur mindestens 24 Stunden lang stabil (Abb. 1, Ergänzungstabelle S1). In der vorliegenden Studie haben wir jedoch insbesondere frisch zubereitete Suspensionen zur täglichen Verabreichung an die Ratten während der Verabreichungsphase der Verbindung verwendet.

Oral verabreichtes WSWPE führte weder bei männlichen noch bei weiblichen Ratten, die der 28-tägigen Behandlungs- und der 14-tägigen Erholungsgruppe zugeordnet wurden, zu Mortalität, Morbidität oder abnormalen klinischen Symptomen (Ergänzungstabelle S2). Darüber hinaus ergaben die detaillierten klinischen Untersuchungen, die jede Woche durchgeführt wurden, bei keinem Tier während der gesamten Studiendauer klinische Anomalien, die mit dem Extrakt in Zusammenhang stehen könnten (Ergänzungstabelle S3).

Im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollgruppen führte die orale Verabreichung von WSWPE zu keiner statistisch signifikanten Veränderung des absoluten Körpergewichts der Tiere beiderlei Geschlechts, die sowohl der Haupt- als auch der Erholungsgruppe zugeordnet wurden (Abb. 2A, B). Ebenso war der wöchentliche Futterverbrauch bei den Ratten aller Behandlungsgruppen vergleichbar (Abb. 2C, D).

Körpergewicht (Mittelwert ± Standardabweichung) und Nahrungsaufnahme (Mittelwert) von männlichen (A bzw. C) und weiblichen (B bzw. D) Ratten, denen WSWPE in Dosen von 0, 100, 300 und 1000 mg oral verabreicht wurde /kg/Tag, für 28 Tage, gefolgt von einer 14-tägigen behandlungsfreien Erholungsphase, wie in den Methoden beschrieben.

Ratten beiderlei Geschlechts, die der Kontrollgruppe und der Hochdosisgruppe aus der Hauptstudie zugeordnet wurden, wurden in der letzten Woche der Verabreichung der Verbindung/des Vehikels auf etwaige anomale Ergebnisse am Auge untersucht. WSWPE führte im Vergleich zur Gruppe, der das Vehikel verabreicht wurde, zu keiner erkennbaren Anomalie (Ergänzungstabelle S4). Folglich wurden die Tiere, denen die niedrige und mittlere Dosis des Extrakts verabreicht wurde, nicht untersucht.

Die hämatologischen Parameter bei den Tieren sowohl der 28-tägigen Behandlungs- als auch der 14-tägigen Erholungsgruppe, die WSWPE erhielten, waren größtenteils denen ihrer jeweiligen Kontrollgruppen ähnlich (Tabelle 1). Allerdings wurde bei den den Hauptstudiengruppen zugeordneten Ratten ein statistisch signifikanter Anstieg der Anzahl weißer Blutkörperchen und des mittleren Blutkörperchenvolumens zusammen mit einem signifikanten Rückgang der Thrombozytenzahl bei männlichen Ratten festgestellt, denen die mittlere Dosis WSWPE (300) verabreicht wurde mg/kg/Tag) im Vergleich zur Kontrollgruppe (p < 0,05). Diese Beobachtungen können aufgrund fehlender Dosisabhängigkeit nicht direkt mit der Verabreichung von WSWPE in Verbindung gebracht werden und können dementsprechend als Zufallsbefunde eingestuft werden. Im Erholungsarm zeigten die männlichen Tiere, denen WSWPE verabreicht wurde, im Vergleich zur Kontrollgruppe eine statistisch signifikante Abnahme (p < 0,05) der Gesamterythrozytenzahl und des Hämatokrits. Diese Ergebnisse können nicht explizit der WSWPE zugeschrieben werden, da sie innerhalb der historischen Referenzbereiche für Kontrolltiere11 und am Untersuchungsort liegen. Darüber hinaus wurden diese Ergebnisse bei weiblichen Tieren, die dem Erholungsarm zugeordnet waren, nicht bestätigt.

Bei Tieren weiblichen Geschlechts, die der Hauptstudie zugeordnet wurden, war der Hämatokrit bei Ratten, denen die mittlere Dosis WSWPE (300 mg/kg/Tag) verabreicht wurde, im Vergleich zum Vehikel signifikant erhöht (p < 0,05). -verwaltete Gruppe. Darüber hinaus war das mittlere Korpuskularvolumen im Vergleich zur Kontrollgruppe bei den Tieren, die die niedrige Dosis (100 mg/kg/Tag) erhielten, signifikant verringert (p < 0,05), bei den Ratten, die die niedrige Dosis erhielten, jedoch signifikant höher (p < 0,05). die mittlere (300 mg/kg/Tag) bzw. die hohe Dosis (1000 mg/kg/Tag) von WSWPE. Darüber hinaus war die mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration bei Tieren, denen die niedrige Dosis (100 mg/kg/Tag) verabreicht wurde, signifikant erhöht (p < 0,05), während sie bei Tieren, die die mittlere Dosis (300 mg/kg/Tag) erhielten, signifikant verringert war hoch (1000 mg/kg/Tag) des Extrakts. Alle diese beobachteten Veränderungen bei Frauen können nicht auf WSWPE zurückgeführt werden, da sie nicht dosisabhängig waren. Darüber hinaus ist es unwahrscheinlich, dass sie von klinischer Bedeutung sind, da die Werte innerhalb der historischen Referenzbereiche für die Kontrolltiere und am Untersuchungsort liegen.

Schließlich wurden keine groben oder histopathologischen Veränderungen in der Milz oder im Knochenmark von Tieren beobachtet, die die hohe WSWPE-Dosis erhielten, was diese hämatologischen Ergebnisse sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Ratten aufklären könnte.

Diese Studie untersuchte auch die Wirkung von WSWPE auf Blutgerinnungsparameter, einschließlich der Prothrombinzeit und der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit. Beide untersuchten Parameter blieben nach der oralen Verabreichung von WSWPE sowohl bei Männern als auch bei Frauen im Haupt- und Erholungsarm weitgehend unbeeinflusst (Tabelle 1). Dennoch wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe eine geringfügige, aber statistisch signifikante Verkürzung (p < 0,05) der Prothrombinzeit sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Ratten beobachtet, die dem Hauptstudienarm zugeordnet waren und denen die hohe Dosis WSWPE (1000 mg) verabreicht wurde /kg/Tag). Bei weiblichen Tieren, die dem Erholungsarm zugeordnet wurden, wurde bei den Tieren, denen WSWPE verabreicht wurde, ein signifikanter Anstieg (p < 0,05) der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit festgestellt. Es ist unwahrscheinlich, dass diese Ergebnisse von klinischer Bedeutung sind, da die Werte deutlich innerhalb der für SD-Ratten und am Ort der Studie beschriebenen Referenzbereiche liegen.

Die klinisch-chemischen Parameter blieben nach der oralen Verabreichung von WSWPE sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Tieren im Großen und Ganzen unverändert (Tabelle 2). Dennoch wurde bei männlichen Tieren, die den 28-Tage-Behandlungsgruppen zugeordnet waren, ein signifikanter Anstieg (p < 0,05) des Cholesterinspiegels bei Ratten beobachtet, die die niedrige (100 mg/kg/Tag) und hohe Dosis (1000 mg/kg/Tag) erhielten. Tag) von WSWPE im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Darüber hinaus wurden im Vergleich zur Kontrollgruppe bei Ratten, denen die mittlere Dosis (300 mg/kg/Tag) des Extrakts verabreicht wurde, signifikant erhöhte Na+-Serumspiegel festgestellt (p < 0,05). Diese beobachteten Veränderungen waren jedoch nicht dosisabhängig. Darüber hinaus führte die Verabreichung von WSWPE an männliche Ratten in einer Dosis von 1000 mg/kg/Tag im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einem signifikanten Anstieg des Gesamtbilirubinspiegels (p < 0,05). Obwohl dieser Effekt dosisabhängig ist, ist es unwahrscheinlich, dass er klinisch relevant ist, da der aufgezeichnete Wert deutlich innerhalb des für SD-Ratten und am Untersuchungsort beschriebenen Referenzbereichs lag. In ähnlicher Weise wurde im Erholungsarm bei Tieren, denen WSWPE verabreicht wurde, im Vergleich zur Kontrollgruppe ein signifikanter Anstieg des Werts der alkalischen Phosphatase (p < 0,05) festgestellt, und dieser Wert lag ebenfalls innerhalb der historischen Referenzbereiche, wodurch das Risiko eines potenziellen Anstiegs eliminiert wurde Übersetzung in jede klinische Konsequenz.

Bei weiblichen Tieren, die dem Hauptstudienarm zugeordnet wurden, wurde bei Ratten, die die mittlere Dosis (300 mg/kg/Tag) WSWPE erhielten, ein signifikanter Anstieg des Gesamtbilirubinspiegels beobachtet (p < 0,05). Dieser Befund war jedoch nicht dosisabhängig. Bei weiblichen Ratten, die dem Erholungsarm zugeordnet wurden, wurde im Vergleich zur entsprechenden Kontrollgruppe eine statistisch signifikante Abnahme (p < 0,05) des Serum-Na+-Spiegels beobachtet. Dennoch lag diese Veränderung deutlich im Referenzbereich und am Ort der Studie.

Die orale Verabreichung von WSWPE an Ratten beiderlei Geschlechts, die sowohl dem Haupt- als auch dem Erholungsstudienarm zugeordnet wurden, hatte im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollgruppen keinen signifikanten Einfluss auf die Urinanalyseparameter (Tabelle 3).

Die relativen Organgewichte männlicher und weiblicher Ratten, denen WSWPE verabreicht wurde, sowohl der Haupt- als auch der Erholungsgruppe zugeordnet, waren mit denen ihrer jeweiligen Kontrollgruppen vergleichbar (Tabelle 4).

Die makroskopische Untersuchung der Organe, die männlichen und weiblichen Ratten entnommen wurden, die WSWPE erhielten, ergab weder in der 28-Tage-Behandlungsgruppe noch in der 14-Tage-Erholungsgruppe pathologische Läsionen (Ergänzungstabelle S5).

Eine mikroskopische Gewebeuntersuchung wurde bei männlichen und weiblichen Ratten der Hauptstudiengruppe durchgeführt, denen jeweils das Vehikel und die hohe Dosis WSWPE (1000 mg/kg/Tag) verabreicht wurden. Die Tiere, die die hohe WSWPE-Dosis erhielten, zeigten keine abnormalen histologischen Merkmale, die speziell dem Extrakt zugeschrieben werden können (Abb. 3 und Abb. 4; Ergänzungstabelle S6).

Repräsentative histologische Mikrofotografien ausgewählter Organe von Ratten, die in dieser nichtklinischen Sicherheitsstudie über eine Gesamtdauer von 28 aufeinanderfolgenden Tagen entweder das Vehikel (0,5 % Methylcellulose) oder die hohe Dosis (1000 mg/kg/Tag) WSWPE oral erhielten. Gewebeschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Folgende Organe wurden für die Bildgebung verarbeitet: Großhirn, Lunge, Knochenmark (× 100); Leber, Niere, Herz, Skelettmuskel, Hoden, Eierstock (× 400).

Repräsentative histologische Mikrofotografien ausgewählter Organe von Ratten, die in dieser nichtklinischen Sicherheitsstudie über eine Gesamtdauer von 28 aufeinanderfolgenden Tagen entweder das Vehikel (0,5 % Methylcellulose) oder die hohe Dosis (1000 mg/kg/Tag) WSWPE oral erhielten. Gewebeschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Nebenniere (× 40); Luftröhre, Harnblase, Gebärmutter (× 100); Hypophyse, Bauchspeicheldrüse, Schilddrüse, Samenblase, Prostata, Brustdrüse (× 400).

Obwohl die Wurzeln der Pflanze Withania somnifera hauptsächlich für die Zubereitung klassischer ayurvedischer Rezepturen verwendet werden, deuten moderne wissenschaftliche Untersuchungen darauf hin, dass die oberirdischen Teile der Pflanze, nämlich Blätter, Stängel, Früchte und Samen, auch mehrere biologisch aktive Phytobestandteile besitzen. Die präklinischen pharmakologischen In-vitro- und In-vivo-Aktivitäten der genannten Luftteile wurden mit positiven Ergebnissen untersucht. Um es näher zu erläutern: Die Blattextrakte der Pflanze Withania somnifera haben präklinisch mehrere pharmakologische Wirkungen gezeigt, wie z. B. krebshemmende Wirkung12,13,14,15,16, entzündungshemmende Wirkung17,18, angstlösende und schlaffördernde Wirkung18,19, kardioprotektive Wirkung20, antidiabetische Wirkung21. 22, antimikrobiell23,24 und antiosteoporotisch25. Darüber hinaus wurde in bestimmten Studien festgestellt, dass die aus den Blättern hergestellten Extrakte im Vergleich zu den Wurzeln von Withania somnifera eine überlegene Wirkung besitzen. Beispielsweise wurde berichtet, dass ein 50 % ethanolischer Extrakt, der aus den Blättern und Stängeln von Withania somnifera hergestellt wurde, im Vergleich zu einem ähnlichen Extrakt, der aus den Wurzeln hergestellt wurde, eine überlegene zytotoxische In-vitro-Aktivität gegen mehrere menschliche Krebszelllinien besitzt26.

Es wurden auch klinische Untersuchungen durchgeführt, um die Wirksamkeit und Sicherheit von Withania somnifera-Formulierungen einschließlich der Blätter zu bewerten. Eine solche Formulierung, die aus den kombinierten Extrakten der Blätter und Wurzeln besteht, hat klinische Wirksamkeit bei der Verbesserung der kognitiven und psychomotorischen Leistung27 und der Verringerung von Schmerzen, Gelenksteifheit und Behinderung bei Patienten mit Arthrose gezeigt28. Es ist bekannt, dass die spezifischen Extrakte der Beeren von Withania somnifera antioxidative6 und krebsbekämpfende Wirkungen29 besitzen. Es ist auch bekannt, dass die Withania somnifera-Stammextrakte eine krebshemmende Wirkung besitzen26.

Eine kürzlich durchgeführte Studie hat außerdem gezeigt, dass die aus den Samen von Withania somnifera extrahierten Fettsäuren durch 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) verursachte Psoriasis-ähnliche Hautläsionen bei Mäusen reparierten, indem sie die Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine modulierten -Vitro-Bedingungen7. Zusammengenommen haben neben den Wurzeln auch die anderen oberirdischen Teile der Pflanze Withania somnifera aus klinischer Sicht sowohl therapeutisches als auch prophylaktisches Potenzial.

Um die bevorstehenden nichtklinischen Sicherheitsuntersuchungen an Nicht-Nagetieren und die künftigen Wirksamkeits- und Sicherheitsstudien an Menschen zu unterstützen, haben wir daher das Sicherheitsprofil eines hydromethanolischen Extrakts bewertet, der aus der gesamten Pflanze von Withania somnifera (WSWPE) hergestellt wurde. die auch die Wurzeln einbezieht. Wir berichten hier zum ersten Mal über eine GLP-gesteuerte subakute Toxizitätsbewertung, bei der männlichen und weiblichen Ratten über einen Studienzeitraum von 28 Tagen kontinuierlich WSWPE auf oralem Weg verabreicht wurde, gefolgt von einer 14-tägigen Erholungsphase ohne Extraktverabreichung eine Satellitengruppe von Tieren.

In der vorliegenden Studie beobachteten wir nach der Verabreichung von WSWPE an Ratten beiderlei Geschlechts keine Mortalität oder abnormale klinische Symptome; keine signifikante Auswirkung auf das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme und keine ophthalmologischen Aberrationen im Vergleich zu den Tieren, denen das Vehikel verabreicht wurde, sowohl im Haupt- als auch im Erholungsarm. Ebenso wurden am Ende der Studie keine groben pathologischen Veränderungen in irgendeinem Organ beobachtet und die Organgewichte waren vergleichbar mit denen der Tiere, die nur das Vehikel erhielten. Auch die mikroskopische Untersuchung der Organe von Tieren, denen die höchste Dosis des Extrakts verabreicht wurde, ergab keine WSWPE-bedingten Veränderungen. Ebenso waren die qualitativen Urinanalyseparameter zwischen der Vehikel- und der WSWPE-verabreichten Gruppe sowohl im Haupt- als auch im Erholungsarm gleichwertig. Dennoch konnten wir einige statistisch signifikante Veränderungen in den Parametern Hämatologie, Gerinnung und klinische Chemie feststellen. Diese Veränderungen wurden unserer Ansicht nach nicht als nachteilig angesehen und standen darüber hinaus auch nicht explizit im Zusammenhang mit WSWPE, da sie weder nicht dosisabhängig waren noch durch das Nichtvorhandensein makro- oder mikroskopischer Befunde in den zu diesem Zeitpunkt entnommenen Organen erklärbar waren der Autopsie. Darüber hinaus ist es unwahrscheinlich, dass die Ergebnisse von klinischer Bedeutung sind, da die ausgewerteten Parameter, bei denen statistische Signifikanz festgestellt wurde, innerhalb der historischen Referenzbereiche lagen, die für SD-Ratten am Standort der Studie beschrieben wurden. Folglich wurde, wie aus der Studie hervorgeht, der NOAEL von WSWPE bei SD-Ratten auf 1000 mg/kg/Tag bestimmt.

Obwohl wir bekräftigen, dass es sich bei der vorliegenden Studie um die erste Beschreibung der nichtklinischen Sicherheitsbewertung von WSWPE handelt, ist es erwähnenswert, kurz die bestehenden nichtklinischen Sicherheitsprofile zu beschreiben, die öffentlich zugänglich für die aus den Wurzeln von Withania somnifera gewonnenen Extrakte sind sowie seine Phytobestandteile.

Über die akute und subakute Sicherheitsbewertung eines ethanolischen Extrakts aus Withania somnifera-Wurzeln wurde berichtet, wobei der Extrakt Mäusen bzw. Ratten beiderlei Geschlechts auf intraperitonealem Weg verabreicht wurde30. In der akuten Toxizitätsstudie wurde die LD50 des Wurzelextrakts bei Mäusen mit 1260 mg/kg ip bestimmt. In der anschließenden Bewertung der subakuten Toxizität erhielten männliche und weibliche Wistar-Ratten den Extrakt in einer Dosis von 100 mg/kg ip wiederholt über 30 Tage. Bei keinem Tier wurde eine Mortalität beobachtet und im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe wurden keine signifikanten Unterschiede bei der Nahrungs- und Wasseraufnahme sowie bei der Körpergewichtszunahme nach der Verabreichung des Extrakts festgestellt. Eine signifikante Abnahme des absoluten Gewichts von Milz, Nebennieren und Thymus wurde jedoch nur bei männlichen Tieren berichtet. Die Untersuchung der hämatologischen Parameter ergab einen signifikanten Anstieg der Hämoglobinkonzentration, während die klinisch-chemischen Parameter weitgehend unverändert blieben. Schließlich wurden bei allen Tieren in keinem Organ grobe oder histologische Veränderungen festgestellt. In einer weiteren akuten Toxizitätsstudie, die gemäß der OECD-Richtlinie 420 durchgeführt wurde, wurden weiblichen Albinomäusen wässrige, hydroalkoholische und ethanolische Extrakte der getrockneten Wurzeln von Withania somnifera oral verabreicht, wobei alle Extrakte bis zu 2000 mg/kg als sicher galten. po31. In einer anderen Studie wurde männlichen Wistar-Ratten ein wässriger Extrakt der Pflanzenwurzeln in einer Dosis von 3000 mg/kg sieben Tage lang oral verabreicht, wobei keine extraktbedingten Todesfälle, offensichtliche klinische Anzeichen von Toxizität, Stress und negative Auswirkungen auf die Nahrung auftraten und Wasseraufnahme festgestellt32. Die Bewertung der akuten Toxizität eines Wurzelextrakts von Withania somnifera, standardisiert für Withaferin-A, wurde weiblichen Wistar-Ratten oral in Dosen von 500, 1000 und 2000 mg/kg verabreicht33. In dieser Studie wurde ein LD50-Wert von mehr als 2000 mg/kg angegeben und der Extrakt wies keine Verhaltenseffekte auf und darüber hinaus wurden keine groben Organpathologien festgestellt. In derselben Studie wurde außerdem die subakute Toxizität desselben Extrakts bei männlichen und weiblichen Ratten untersucht, denen der Extrakt in Dosen von 500, 1000 und 2000 mg/kg verabreicht wurde. Auch in diesem Experiment wurden keine größeren Toxizitäten festgestellt und die beobachteten Veränderungen bei bestimmten hämatologischen und klinisch-chemischen Parametern lagen innerhalb der für Ratten definierten Referenzbereiche, wie auch in unserer Studie beobachtet. Darüber hinaus wurden keine makro- oder mikroskopischen Organpathologien festgestellt, weshalb der NOAEL mit 2000 mg/kg angenommen wurde. In einer anderen verwandten Studie wurde ein aus den Wurzeln von Withania somnifera hergestellter hydroalkoholischer Extrakt auf seine akute und subakute Toxizität untersucht34 und die Schlussfolgerungen der Studie entsprachen genau denen der zuvor zitierten Studie33. Darüber hinaus wurde in einer Studie die subchronische Toxizität eines reinen Withania somnifera-Extrakts untersucht, wobei der Extrakt Ratten über eine Studiendauer von 90 Tagen in Dosen von 100, 500 und 1000 mg/kg/Tag oral verabreicht wurde35. In dieser Studie wurde der NOAEL auf 1000 mg/kg/Tag geschätzt, da der Extrakt bis zu dieser Dosis keine offensichtlichen Toxizitäten aufwies. Schließlich wurde in einer chronischen Toxizitätsstudie an Ratten, denen 250 mg/kg des Extrakts 8 Monate lang oral verabreicht wurden, festgestellt, dass ein wässriger Wurzelextrakt nicht toxisch ist1. Einige Ergebnisse dieser Studie waren jedoch ein signifikanter Anstieg des Körpergewichts und des Lebergewichts sowie ein signifikanter Rückgang des Cortisolspiegels im Plasma.

Es wurden auch Bewertungen der akuten Toxizität der bioaktiven Bestandteile von Withania somnifera durchgeführt, die auch in WSWPE nachgewiesen wurden. Es wurde berichtet, dass die LD50 von Withaferin A bei Ratten auf oralem Weg 670 mg/kg beträgt, und die LD50 von Withanon wurde bei Ratten, die den reinen Phytobestandteil auf oralem Weg erhielten, auf mehr als 400 mg/kg berechnet1. Die für Withaferin A und Withanon gemeldeten hohen LD50-Werte untermauern das in unserer Studie beobachtete akzeptable Sicherheitsprofil weiter, da die Menge dieser beiden in WSWPE vorhandenen Bestandteile nur einen Bruchteil der gemeldeten LD50-Werte ausmacht.

Im Vergleich zum veröffentlichten nichtklinischen Sicherheitsprofil des Wurzelextrakts beobachteten wir in unserer Studie auch keine Toxizitäten mit dem hydromethanolischen Extrakt, der aus der gesamten Pflanze von Withania somnifera gewonnen wurde. Wir gehen davon aus, dass aufgrund der Ähnlichkeit der Phytobestandteile der Wurzeln und der gesamten Pflanze, einschließlich ihrer oberirdischen Teile, nämlich Blätter, Stängel, Beeren und Samen, ein mit den Wurzeln vergleichbares Sicherheitsprofil der oberirdischen Teile zu erwarten ist.

Dieses beobachtete akzeptable subakute Toxizitätsprofil von WSWPE ermöglicht eine weitere Bewertung seiner nichtklinischen Sicherheit bei Nicht-Nagetieren und seiner subchronischen und chronischen Toxizitätsbewertung bei Nagetieren. Basierend auf den Studienergebnissen kann die Wirksamkeit und Sicherheit von WSWPE letztendlich auch auf Patienten ausgeweitet werden, die an Erkrankungen leiden, für die WSWPE einen potenziellen therapeutischen Wert hat.

Die nichtklinische subakute Toxizitätsbewertung von WSWPE wurde durch wiederholte orale Verabreichung an Sprague-Dawley-Ratten beiderlei Geschlechts über einen Zeitraum von insgesamt 28 Tagen in Dosen von 100, 300 und 1000 mg/kg/Tag gemäß OECD-Test durchgeführt Richtlinie 407, in Übereinstimmung mit den OECD-GLP-Grundsätzen. Darüber hinaus umfasste das Studiendesign auch einen Erholungsarm, in dem sowohl männlichen als auch weiblichen Ratten 28 Tage lang das Vehikel und die hohe Dosis WSWPE verabreicht wurden. Anschließend wurde die Verabreichung des Extrakts abgebrochen und die Ratten auf Umkehrung, Persistenz usw. beobachtet verzögertes Auftreten unerwünschter Folgen um weitere 14 Tage. In der vorliegenden Studie ergab die WSWPE im Vergleich zu den mit Vehikel behandelten Gruppen keine klinisch signifikanten Veränderungen der bewerteten Parameter. Basierend auf der oben genannten Prämisse wurde der NOAEL für WSWPE sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Ratten auf 1000 mg/kg/Tag festgelegt. Folglich ermöglichen die Ergebnisse eine weitere nichtklinische Sicherheitsbewertung von WSWPE bei Nicht-Nagetieren und für eine längere Dauer bei Nagetieren. Darüber hinaus ebnet diese Studie auch den Weg für die detaillierte Untersuchung des Withania somnifera-Ganzpflanzenextrakts unter klinischen Bedingungen.

Die für die vorliegende Studie generierten Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Dr. Pralhad Wangikar, Dr. Sachin Shinde, Dr. Pradhnya Choudhary und dem wissenschaftlichen Personal von PRADO, Pune, Indien für die Durchführung dieser GLP-Toxizitätsstudie; Frau Meenu Tomer für Unterstützung in der analytischen Chemie; und Dr. Preeti Raj und Dr. Kunal Bhattacharya für ihre hervorragende Hilfe bei der Grafik. Wir danken Herrn Tarun Rajput, Herrn Gagan Kumar und Herrn Lalit Mohan für ihre schnelle administrative Unterstützung.

Abteilung für Arzneimittelforschung und -entwicklung, Patanjali Research Institute, NH-58, Roorkee-Haridwar Road, Haridwar, Uttarakhand, 249 405, Indien

Acharya Balkrishna, Sandeep Sinha, Jyotish Srivastava und Anurag Varshney

Abteilung für alliierte und angewandte Wissenschaften, Universität Patanjali, NH-58, Haridwar, Uttarakhand, 249405, Indien

Acharya Balkrishna und Anurag Varshney

Patanjali UK Trust, Glasgow, Großbritannien

Acharya Balkrishna

Spezialzentrum für Systemmedizin, Jawaharlal Nehru University, Neu-Delhi, 110067, Indien

Anurag Varshney

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AB gab eine grobe Richtung für die Studie vor, identifizierte die Testformulierungen, generierte Ressourcen und erteilte die endgültige Genehmigung für das Manuskript; SS überwachte die In-vivo-Studie, führte eine Datenbereinigung durch und verfasste das Manuskript; JS überwachte die chemische Charakterisierung und Stabilitätsanalyse der Formulierung des Testgegenstandes; AV überwachte, überwachte Gesamtstudien, generierte Ressourcen, überprüfte das Manuskript kritisch und genehmigte es schließlich. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Anurag Varshney.

Acharya Balkrishna ist Treuhänder des Divya Yog Mandir Trust in Haridwar, Indien, der die Divya Pharmacy in Haridwar verwaltet. Darüber hinaus ist Acharya Balkrishna einer der Gründungsförderer und hat eine ehrenamtliche Führungsposition bei Patanjali Ayurved Ltd., Haridwar, Indien, inne. Divya Pharmacy und Patanjali Ayurved Ltd produzieren und verkaufen kommerziell mehrere ayurvedische Produkte. Divya Pharmacy und Patanjali Ayurved Ltd waren an keinem Aspekt dieser Studie beteiligt. Alle anderen Autoren, Sandeep Sinha, Jyotish Srivastava und Anurag Varshney, waren am Patanjali Research Institute beschäftigt, das vom Patanjali Research Foundation Trust (PRFT), Haridwar, Uttarakhand, Indien, einer gemeinnützigen Organisation, geleitet wird. Darüber hinaus ist Anurag Varshney außerordentlicher Professor am Department of Allied and Applied Sciences der University of Patanjali, Haridwar, Indien; und im Spezialzentrum für Systemmedizin, Jawaharlal Nehru University, Neu-Delhi, Indien. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Balkrishna, A., Sinha, S., Srivastava, J. et al. Der Ganzpflanzenextrakt von Withania somnifera (L.) Dunal zeigt eine akzeptable nichtklinische Sicherheit in der 28-tägigen subakuten Toxizitätsbewertung an Ratten unter GLP-Konformität. Sci Rep 12, 11047 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14944-x

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Eingegangen: 08. November 2021

Angenommen: 15. Juni 2022

Veröffentlicht: 30. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14944-x

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